中缅树鼩自然感染六种病毒的血清流行病学

中缅树鼩作为一种新型实验动物,在医学生物学上,尤其是病毒学方面的应用受到越来越多的重视.实验动物自身病毒感染会影响动物健康和干扰实验结果,甚至危害实验人员生命安全.所以,实验动物病毒检测一直是动物质量控制的重要部分.中缅树鼩研究迄今缺乏清晰的病毒自然感染资料.为调查中缅树鼩的病毒感染状况,采集野生俘获和人工繁殖的中缅树鼩血清样本272份,全部血清样本通过ELISA方法对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原,丙型肝炎病毒(HCV)总抗体,以及戊型肝炎病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和2型(HSV-2)的IgG抗体进行了检测.结果表明,ELISA初筛HBV表面抗原有3份阳性样本,但通过乙型肝炎两对半定量检测进一步确认为阴性:抗HCV抗体和抗HEV、ADV、HSV-1 IgO抗体检测均为阴性;抗HSV-2 IgG检测有1份阳性样本.提示仪抗原或抗体血清学指标检测树鼩肝炎结果并不能反应个体携带病毒的状态,应该再进行病毒学指标确认.同时建议中缅树嗣繁殖群应进行HSV-2的筛选,以便杜绝和控制该病毒的感染.     

呼肠孤病毒感染的树鼩中三类CD分子及IFN-γ表达变化及特征

目的探讨树鼩呼肠孤病毒激起机体免疫变化的特征,为树鼩的病毒防范提供理论基础。方法选取40~50日龄的树鼩分为三组(MRV1/TS/2011病毒株、MRV3/TS/2013病毒株和空白对照),通过灌胃后,采集第1、8、14、21、28天尾静脉血样,RT-PCR检测病毒载量、流式细胞术检测CD4/CD8/CD19、ELISA检测IFN-γ。结果感染第14天,MRV1/TS/2011和MRV3/TS/2013组的树鼩病毒载量、CD_4~+及CD19+细胞数量达峰值,其中经MRV1/TS/2011感染后第1天CD_4~+就有较高表达且数值与对照组相比差异有显著性,CD_8~+细胞数量及IFN-γ表达量在感染后第21天达到峰值。CD_4~+经MRV1/TS/2011感染后表达量更高,CD_8~+经MRV3/TS/2013感染后表达量更高。结论初步得出MRV1/TS/2011及MRV3/TS/2013感染机体后,随病毒载量变化,CD4/CD8/CD19及IFN-γ产生的变化规律:MRV1/TS/2011感染前期主要激起机体体液免疫,CD_4~+细胞发挥主要作用;MRV3/TS/2013可能主要影响机体细胞免疫,体液免疫只在病毒表达量显著升高及感染后期发挥作用,CD_8~+细胞和IFN-γ通过细胞免疫参与抗病毒反应。CD_4~+细胞可能对1型呼肠孤病毒更敏感,而CD19细胞+可能对3型呼肠孤病毒更敏感。对树鼩呼肠孤病毒的感染特征研究和树鼩本身的病毒防范有一定指导意义。     

树鼩实验感染基孔肯雅病毒的研究

选用3株基孔肯雅病毒人工感染成年树鼩,进行了病毒血症、抗体动态变化、内脏组织病理改变和病毒在宿主体内定位的研究。结果表明,感染树鼩能产生2～6天的病毒血症。血凝抑制(Hi)抗体第6天产生,第30～50天达高峰:中和(NT)抗体在第10天产生,第30～40天达高峰,二者相关性非常显著(P<0.01)。补体结合(CF)抗体第14天产生,第40～50天为高峰,以后逐渐下降。第8～12天能在其脑、肺、肝、脾和肾等组织查到病毒,经病理检查这些内脏组织呈炎性改变和出血倾向,表明该病毒能侵袭树鼩各主要脏器。试验认为树鼩对基孔肯雅病毒敏感。     

一株红树林真菌抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的研究

目的:对分离自海南红树林真菌菌株PH0016的胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)活性进行研究。方法:收集纯化菌株PH0016产生的EPS,体外采用细胞病变观察EPS的细胞毒性和抗HSV-2作用。为观察EPS对HSV-2体内感染的治疗效果,小鼠颅内注射0.02ml滴度为100LD50/0.1ml-1的HSV-2,24小时后以不同浓度EPS灌胃,持续7天,14天后计算小鼠存活率和存活时间。菌株分类采用形态学观察和ITS序列分析。结果:EPS可抑制HSV-2病毒活性,病毒感染的细胞病变的半抑制浓度(Inhibited concentration,IC50)为313μg/mL,SI为11.43。EPS 25mg.kg-1.d-1灌胃后,小鼠存活率为40.0%,存活时间为9.82±1.87天,相比模型组实验动物存活时间和存活率均有提高。菌株初步鉴定为淡紫色拟青霉。结论:从海南红树林分离一株淡紫色拟青霉,其产生的EPS具有抗HSV-2活性,值得进一步研究。     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

树鼬对森林脑炎病毒的敏感性及发病机理的研究

从云南新分离森林脑炎病毒(YH和T57)及东北株经脑内、皮下及腹腔感染成年中国云南树鼩,均发生病毒血症。持续时间为7—9天。抗体应答反应和病理改变程度成反比,病变轻的能产生较好的免疫应答。血凝抑制抗体、中和抗体和补体结合抗体分别于感染后的第5、7、13天出现,且血凝抑制抗体和中和抗体的升高呈正相关。经抗原定位研究发现,腹腔注射后48小时,各组织器官均能查到抗原,除中枢神经系统外,其它组织内病毒抗原消失都很快,随病毒血症的消失而转阴,中枢神经系统携带抗原可持续27天,且病变随病程的延长而加重,表现为充血、血管周围淋巴细胞呈套状浸润,局灶性出血,神经元变性,胶质细胞增生,轴索断裂等,说明靶器官是中枢神经系统。试验表明,成年中国云南树勉对森林脑炎病毒比较敏感,是森林脑炎病毒动物模型研究首选动物。     

连续光照和连续黑暗对成年树鼩生殖系统的影响

为探讨光照因子对树鼩(Tupaia belangeri chinensis)季节性繁殖的调节作用,我们采用连续光照与连续黑暗的方式分不同生殖阶段进行了实验。1.材料与方法实验用树鼩均采自昆明市禄劝县。每年3—8月为树鼩生殖季节,9—2月为非生殖季节。每次实验随机分为连续光照组、连续黑暗组和自然光照组(对照组)。第一次实验从1986年2—3月(共28天),为生殖开始期;第二次实验从1986年3—5月(共57天)为生殖期;第三次实验从1986年11月至1987年2月(共91天),为非生殖期;其中对照组数据来自1989年10—12月的实验(共83天)。每组动物数目均多于或等于10只。按雌:雄=1:1配对笼养。因实验过程中往往有死亡,故实验结束时有差异。连续光照组     

HSV-2阴道感染并诱导小鼠阴道粘膜上皮细胞凋亡

最近的报道指出,某些病毒有诱导体外细胞凋亡的作用,借以限制病毒的扩散.为探讨HSV-2在体内诱导细胞凋亡的效果及其形态学特点,用HSV-2 333株感染小鼠阴道,于感染后不同天数处死动物,取其阴道,固定于10%中性福尔马林,TUNEL末端标记染色显示凋亡的细胞,光镜下进行原位观察.结果显示感染后的第1天粘膜上皮内即出现大量的凋亡细胞,第2天至11天凋亡细胞的数量及在上皮内的分布范围达最高水平.早期的凋亡细胞见于感染后所有标本,其核染色质形态及分布似正常细胞,但它被TUNEL标记染成棕黄色;晚期的凋亡细胞亦见于所有标本,其胞核缩小,染色质浓缩并在核周边集聚,核中心空化.载有凋亡细胞的上皮在阴道粘膜上分布很广,最广的可占全阴道上皮的2/3.同时可见HSV-2引起的上皮细胞坏死及疱疹形成,二者均由凋亡细胞包围.凋亡细胞不断地由上皮表面脱落至阴道,未见凋亡小体及吞噬现象.结果提示,HSV-2 333株阴道感染可同时诱导细胞坏死及凋亡,细胞凋亡可能在限制病毒产生子代及限制感染区域扩展起重要作用.     

甲型流感病毒免疫治疗S_（37）腹水瘤的实验研究

用甲型流感病毒７５－３９株鼠肺适应型,免疫治疗Ｓ３７腹水瘤小鼠,存活率达９３．３％。体外流感病毒感染Ｓ３７肿瘤细胞,经不同时间观测,到３天时Ｓ３７细胞经胎盘蓝染色发现细胞１００％死亡。而对照组Ｓ３７细胞死亡率为１０％左右（ｐ＜０．０１）。进一步研究病毒免疫治疗Ｓ３７腹水瘤小鼠的机理,发现经病毒感染后小鼠ＮＫ细胞杀伤活性升高达５８％,正常鼠ＮＫ活性为２２％,两者有显著性差异（ｐ＜０．０１）。另外,检测病毒注射后小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性也随之升高。     

臭鼩DNA高重复顺序的研究同树鼩的TSr(Bg1 ll)—1顺序比较

 <正> 树鼩是一种小型哺乳动物,它的分类地位还有争议。有的生物学家认为树鼩属于灵长类,也有的将它归于食虫目。我们已经做了灵长类动物和树鼩DNA特性的比较,表明二者之间的核苷酸顺序虽有一定差异,但在类αDNA的三个进化冷点区域内,有较大的相似性。为了探讨树鼩同食虫目的关系,我们选用了食虫目动物臭鼩进行了研究。 我们用Bellard法提取了臭鼩DNA,分别用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ酶切,发现在经BamHⅠ、BglⅡ两酶消化后,可见到高重复区带,而在同样条件下EcoRⅠ、HindⅢ     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株，为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞，利用差速消化法纯化内皮细胞，然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞，再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞，纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致，到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛，第2～4天时处于对数生长期，第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同，即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能，为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

树鼯对森林脑炎病毒的敏感性及发病机理的研究

从云南新分离森林脑炎病毒（YH和T57）及东北株经脑内、皮下及腹腔感染成年中国云南树鼯,均发生病毒血症,持续时间为7-9天。抗体应答反应和病理改变程度成反比,病变轻的能产生较好的免疫应答。血凝抑制抗体、中和抗体和补体结合抗体分别于感染后的第5、7、13天出发,且血凝抑制抗体和中和抗体的升高呈正相关。经抗原定位研究发现,腹腔注射后48小时,各组织器官均能查到抗原,除中枢神经系统外,其它组织内病毒抗原消失都很快,随病毒血症的消失而转阴,中枢神经系统携带抗原可持续27天,且病变随病程的延长而加重,表现为充血、血管周围淋巴细胞呈套状浸润,局灶性出血,神经元变性,胶质细胞增生,轴索断裂等,说明靶器官是中枢神经系统。试验表明,成年中国云南树鼯对森林脑炎病毒比较敏感,是森林脑炎病毒动物模型研究首选动物。     

树鼩驯养繁殖实验动物标准及丙型肝炎动物模型技术平台建设的探讨

目前用于生物医学研究的树鼩大多数来源于野生捕获,由于个体间的差异较大,其实验结果的均匀性和可重复性较差,亟待解决树鼩人工饲养设施条件、繁殖关键技术、动物质量标准等一系列基础科学问题。许多文献报道了树鼩与其他实验动物比较,在肝病研究中具有巨大的开发应用潜力,在丙型肝炎动物模型研究中,亟待解决丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系、HCV病毒感染剂量与感染途径、HCV病毒对树鼩体外、体内感染后病毒核酸检测、抗体检测和病理检测等技术方法的建立及动物模型评价标准问题。本文就上述问题系统性地进行初步报道,旨在为树鼩早日实现实验动物化和丙型肝炎疾病研究中应用提供科学依据。     

树鼩呼肠孤病毒的分离鉴定

致病性病毒严重危害树鼩(treeshrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径~75nm。纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3:3:4排列。哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株(T3/Bat/Germany/342/08)同源性最高。MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据。     

树免疫细胞体外感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒的实验研究

至今可以感染Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的动物只有黑猩猩和长臂猿,这严重阻碍了HIV-1的疫苗研究和治疗研究。因此,寻找新的可以感染HIV-1的动物模型成为十分迫切的课题。已知树鼩对许多重要的医学病毒易感,为了探讨树鼩是否可以感染HIV-1,利用不同辅助受体的5种HIV-1病毒株,体外感染云南野生成年树鼩的淋巴细胞和单核/巨噬细胞;同时还用这些病毒感染人外周血淋巴细胞或单核细胞。然后用RT-PCR、PCR和流式细胞术分别进行检测。用RT-PCR方法未检测到感染上清中有病毒粒子的存在,用PCR法未能发现树鼩的这些免疫细胞中有前病毒DNA,用流式细胞术也未能在这些感染HIV-1的树鼩细胞的表面检测到特异抗原;而感染HIV-1的人免疫细胞均为阳性结果。实验结果表明树鼩的这些免疫细胞在体外未能感染上HIV-1,可能的原因是树鼩的这些免疫细胞的HIV-1受体(CD4)和辅助受体(CCR5或CXCR4)与人的免疫细胞差别较大。     

驯养中缅树鼩的消化道寄生虫监测及寄生蠕虫驱虫效果

目的了解野外树鼩和驯养树鼩寄生虫感染情况及其驱虫效果。方法 随机选取野外捕获3 d和已驯1个月(未驱虫)、F1代、F2代、F3代树鼩,各五笼,每笼3～4只,用饱和食盐水漂浮法检查粪样虫卵或卵囊,根据形态学鉴定虫种。结果粪样共检获两种寄生性线虫虫卵(毛尾线虫和奇口线虫)、膜壳绦虫卵、一种球虫卵囊。野外捕获3 d和驯养1个月树鼩的线虫卵检出率最高,达100%;绦虫卵检出率分别达60%和20%;球虫卵囊检出率分别达40%和20%。驯养F1代、F2代、F3代树鼩,仅F2代1笼检出线虫卵,检出率为20%。驱虫当天粪样检出的线虫虫卵、绦虫卵和球虫卵囊与驱虫前检出结果比例一致,并收集到39条奇口线虫、3条毛尾线虫、18条长膜壳绦虫。驱虫后第2天和第3天均未收集到虫体,粪样中也未检测到线虫卵和绦虫卵,仅检测到球虫卵囊。结论为树鼩实验动物化的消化道寄生虫病的监测和控制提供基础信息。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞,用EV71感染树鼩肾细胞,测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度,分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达,以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别,建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞,感染后48~96 h病毒滴度可达到1.3×10~6TCID_(50)/m L,说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现,EV71病毒VP1蛋白可在感染后2~8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出,间接免疫荧光法则在感染后2~6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上,确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性,初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白外用治疗单纯疱疹病毒感染

为探讨脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白(EI)外用治疗单纯疱疹病毒感染的作用,分别用HSV-1感染兔子角膜、HSV-2感染豚鼠阴道建立动物感染模型.兔子角膜感染24h后用融合蛋白滴眼液治疗,每天3次,每次0.5ml,共14天.豚鼠阴道感染48h后,用融合蛋白涂剂抹外阴病灶,每天3次,每次10mg,共14天.用IFNα-m和生理盐水/赋形剂作为对照.采用记录病损程度分级法进行临床症消减观察,并于治疗前后测定实验动物病灶病毒滴度、HSV抗体滴度及NK细胞活性.结果显示:与IFNα-m相比,EI治疗组实验动物病毒感染症状大幅减轻且病程缩短,动物病灶中病毒滴度下降,抗HSV抗体滴度升高,NK细胞活性增强.说明脑啡肽干扰素融合蛋白具有较强的消除炎症和局部抗病毒作用,可用于治疗HSV感染引起的疾病.     

茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型的建立

目的采用临床分离的茄病镰刀菌感染树鼩角膜,建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。方法茄病镰刀菌接种到沙保氏培养基,26℃培养箱培养7 d,收集真菌混悬液,血细胞计数板调整孢子数量为1×10~(10)CFU/m L。清洁级树鼩40只随机分为实验组(n=30)、对照组(n=10)。实验组用胰岛素针头(29 G)将真菌孢子混悬液50μL注入角膜基中央,对照组注入生理盐水50μL。通过前段照相、共聚焦显微镜检查、病理组织学变化、感染角膜组织培养对模型进行评价。结果真菌浸润范围、角膜上皮细胞和内皮细胞水肿程度、菌丝数量均与时间呈正相关;炎性细胞浸润数量造模后第7天达到高峰,以中性粒细胞为主;实验各时间点均可见菌丝平行于基质纤维生长;感染后角膜组织培养可见茄病镰刀菌生长;造模成功率为86%。结论采用基质注射茄病镰刀菌孢子的方法首次成功建立茄病镰刀菌性角膜炎树鼩模型。