活的不可培养的细菌的研究进展

活的不可培养微生物(VBNC)即一些微生物明显地丧失了可培养的特性,但是保留了自身原有的代谢活力,并且在一定条件下,又可以回复到可培养的状态。从VBNC细菌的诱导条件、生物学特性和检测方法3个方面对VBNC细菌研究进展做一综述。     

细菌“活的不可培养状态”的生态意义及研究进展

"活的不可培养(VBNC)"状态是细菌在不良条件下的一种生存方式.VBNC状态作为细菌的一种生理状态,对传统微生物学产生了深远的影响.进入VBNC状态的细胞发生了一系列变化,无法继续用常规培养方法检测,在医学健康,环境科学等领域产生了巨大的影响,改进检测方法具有重要的意义.本文介绍了进入VBNC状态细菌在DNA、蛋白质组成等方面发生的变化,复苏过程.同时还介绍了VBNC状态的最新检测方法,最后对VBNC状态未来的研究方法进行了讨论.     

空肠弯曲菌活而不可培养状态的产毒素能力及毒素基因表达的检测

目的 通过诱导空肠弯曲菌进入活的不可培养(VBNC)状态建立细胞学模型,用VeroE6细胞和HeLa细胞检测空肠弯曲菌产细胞膨胀性肠毒素(cytotoxic distendingtoxin,CDT)能力的改变,并在RNA水平上进一步验证毒素的表达。方法 采用4℃冷藏及-70℃冷冻的方法诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态,利用细胞总数计算、活细胞染色计数及可培养细胞计数间接确证VBNC状态细菌的存在,细胞对于VBNC状态下的细菌仍然敏感,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实空肠弯曲菌毒素基因的表达。结果 3种不同状态的细胞计数结果表明存活细胞进入了VBNC状态,细菌经4℃冷藏及-70℃冷冻后数量减少约1个数量级,在冷冻前,细菌对细胞毒性较强,72h时70%以上细胞凋亡,冷冻后的VBNC状态细菌对VeroE6和HeLa细胞的生长仍有影响,72h时约有40%细胞进入凋亡状态。结论 低温、贫养条件下空肠弯曲菌可进入VBNC状态,用常规传统的羊血平板培养基仅能使不到10%的空肠弯曲菌复苏生长,从而可以检测,在VBNC状态时,空肠弯曲菌产毒素能力改变较大,远远低于正常状态,但仍具备产毒素的能力,也从RNA水平实验得到证实。     

活的但非可培养(VBNC) 状态菌的研究进展

VBNC(viable but non-culturable)是指处于"活的但非可培养"状态的微生物,此微生物体的细胞仍有代谢活性,但用常规方法无法分离培养.本文阐述了VBNC状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望.并报道了我们在十余年间针对生态环境中处于VBNC状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果,拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据.     

致病微生物应对环境胁迫形成的VBNC状态及其对风险评估的潜在影响

防止食源性致病菌对食品的污染是保障食品安全的重要策略之一。研究表明,环境胁迫下微生物可能形成"活的不可培养状态"(VBNC状态),成为食品安全的潜在风险。本文对致病微生物VBNC状态的最近发现进行了归纳和总结,重点分析了不同环境胁迫(包括自然胁迫以及食品加工和保藏过程中的各种胁迫等)因素下菌体进入VBNC状态的普遍性、诱导条件和生理特点等,并对现行的基于微生物可培养性而建立起来的常规检测方法的局限性及其对食品安全风险评估潜在影响进行了讨论。     

低温寡营养条件下副溶血弧菌形成活的非可培养状态及其复苏研究

为研究在低温寡营养条件下副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能否进入活的非可培养状态(VBNC),将浓度为1×1010CFU/mL的副溶血弧菌HW799在陈海水中4℃保存,每隔5天取样分别用吖啶橙染色荧光显微镜直接计数法(AODC)、活菌直接计数法(DVC)和涂布平板法(PC)测定细菌总数、活细菌数和可培养细菌数.在第30天时总细菌数基本不变,仍保持在109CFU/mL,活菌数为106CFU/mL,比总菌数低了约三个数量级,可培养细菌数为零,表明绝大部分副溶血弧菌HW799进入了VBNC状态;用扫描电镜、流式细胞仪对副溶血弧菌HW799活的非可培养状态、正常状态以及复苏后的细胞形态的研究表明进入VBNC状态后副溶血弧菌HW799形状变为球状,体积比正常状态明显变小,活细胞数也略有减少;采用在培养液中添加营养物质升温培养的方法,使VBNC状态的副溶血弧菌细胞在48h内复苏为可培养状态,复苏后的副溶血弧菌HW799与正常状态的细菌形态相似.     

开发未可培养微生物技术的研究进展

细菌的“活的非可培养状态”(VBNC, viable but nonculturable)发现于20世纪80年代, 处于此状态的细菌不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力, 而且具有与原菌相似的致病性, 成为可以逃避检测的“隐性”传染源, 对周围的环境及人类安全构成潜在威胁。作为公认的未可培养微生物, 它一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。现代分子生物学技术和基因组学的深入研究, 为开发环境中的未可培养微生物提供了新的研究方法和机遇。其中遗传指纹图谱技术、宏基因组技术显示出一定的优势, 同时, 随着各种细菌的非可培养状态的实验室模型已日臻成熟, 这为开发和利用未可培养微生物资源提供了新的研究思路。     

细菌有活力但不可培养状态及其机制研究进展

有活力但不可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态是细菌遭遇逆境时进入的一种特殊状态,该状态下的菌体在条件适宜时可复苏并恢复其致病性,被认为是细菌躲避不良环境的一种生存策略。VBNC状态菌体对人类医学和工农业生产具有巨大的潜在威胁,开展关于VBNC状态的检测及诱导、复苏及其机制研究可为减少或避免该状态细菌的危害提供理论基础。本文简要综述了细菌VBNC状态在诱导、复苏及致病性等方面的研究进展,并结合本实验室及国内外相关团队近年来在植物病原细菌VBNC状态研究中的结果,详细总结了VBNC状态细菌的形成和复苏机制,对植物病原细菌在环境胁迫下的存活机制、病害田间初侵染来源分析及VBNC状态菌体在病害循环中的作用等相关研究具有重要参考意义。     

活的但非可培养功能菌群对多氯联苯降解的探索进展

活的但非可培养(“viable but non-culturable”,简称VBNC)状态是微生物应对各种环境压力的一种生存机制.面对日益严重的异生质污染问题,研究污染胁迫下VBNC状态菌的潜在环境功能具有重要意义.该文阐述了VBNC状态菌的研究现状,针对多氯联苯微生物降解存在的问题,重点介绍环境中潜在VBNC功能菌群的复苏培养.提出利用藤黄球菌(Micrococcus luteus)复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,简称Rpf)探索具有潜在多氯联苯降解功能的VBNC状态菌群,为多氯联苯高效降解菌群的筛选提供新思路.同时,结合VBNC状态菌絮凝、硝化除臭等方面的探索研究,对VBNC状态菌的潜在环境功能进行了展望.     

无血清培养高密度乳猪肝细胞的形态和功能变化

本文研究了无血清培养高密度猪肝细胞的形态和功能变化。将分离的肝细胞以高密度(1×10~7/ml)培养在含激素、多种生长因子和营养成分的无血清培养基中,动态观察培养7天中肝细胞形态、活率、蛋白质合成功能、G-6-Pase活性、安定转化功能及LDH含量;同时以无血清培养低密度(5×10~5/ml)肝细胞作为对照组。研究结果表明:高密度培养的 肝细胞各项功能较低密度培养的肝细胞为低;高密度培养的肝细胞的形态、蛋白质合成功能在培养7天中保持稳定;活率随着培养时间的延长而下降,但均高于90％;安定转化功能在培养第2、3天最强;G-6-Pase活性在培养1天后明显下降,然后维持在较低水平;LDH含量在第1、2、3天较高。     

实验室薄口螨的大量培养及休眠体的诱导

用玉米粉培养基、BY(牛肉膏+酵母膏)软琼脂培养基、BY培养液3种培养基对实验室薄口螨(Histiostoma laboratorium)进行了培养。其最适培养基是玉米粉培养基;该螨在BY软琼脂培养基上也能生长,但生长速度比较缓慢,经过BY软琼脂培养基的培养,能够收集到大量干净的个体,为DNA提取和分子生物学研究提供了方便;在BY培养液中,实验室薄口螨不能进行继代生长,但能够产生大量的卵,可收集卵做更进一步的深入研究。休眠体是该螨生活史中的重要阶段,是借助携播者进行传播的特殊形式。对孳生于培养有果蝇的玻璃指管中的实验室薄口螨产生的休眠体及其在果蝇体表的吸附状况进行了观察,利用较高温度(30～35℃)培养基逐步干燥、较低温度(10～15℃)、BY液体培养3种方法,可以诱导该螨休眠体集中大量地形成,方便收集休眠体,是对其进行生理生化、基因表达、疾病传播机理等方面研究的先决条件。     

复苏延迟体(regrowth-delay body)作为一种标示休眠细菌的可逆亚细胞结构

大约在1895年前后,人们就注意到一个有趣的现象,那就是在实验室批量培养细菌(如伤寒杆菌)的时候,每当细胞进入快速生长分裂状态之前,总是存在一个无任何生长迹象的潜伏期(latent period)或延迟期(lag phase)。而且这种复苏过程的延迟时间的长短与细胞经历上一次培养过程的时间有关:培养时间越长(细胞越老),复苏的延迟期越长;培养时间越短(细胞越年轻),复苏的延迟期越短[1]。究其原因,当时的观点是经历了长时间培养的细菌细胞受到了损伤,所以再次生长时需恢复一段时间[1]。     

开发未可培养微生物技术的研究进展

细菌的"活的非可培养状态"(VBNC, viable but nonculturable)发现于20世纪80年代,处于此状态的细菌不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力,而且具有与原菌相似的致病性,成为可以逃避检测的"隐性"传染源,对周围的环境及人类安全构成潜在威胁.作为公认的未可培养微生物,它一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一.现代分子生物学技术和基因组学的深入研究,为开发环境中的未可培养微生物提供了新的研究方法和机遇.其中遗传指纹图谱技术、宏基因组技术显示出一定的优势,同时,随着各种细菌的非可培养状态的实验室模型已日臻成熟,这为开发和利用未可培养微生物资源提供了新的研究思路.     

细菌VBNC态检测技术的研究进展

细菌在一些不良压力条件下会进入"活的非可培养状态"(viable but non-culturable,VBNC),其仍具有活力但不能采用常规的平板培养基进行培养,VBNC态细菌一旦培养条件适宜仍能继续生长繁殖,有些致病菌依旧具有毒力。如果检测方法不当,会造成假阳性或假阴性的结果,需要采取适合的检测方法进行检测。文章概述了几种检测VBNC态细菌的方法,如活菌直接计数法、核酸染料检测法、呼吸检测法、分子生物学法、免疫学法、流式细胞仪检测法等,并对检测方法的应用现状进行了评述。     

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

微生物在水环境中的存活和生长

在灭菌自来水模拟水体中,研究了7种细菌的存活和生长规律。Klebsiella pneumo-niae,Enterobacter aerogenes,Agrobacterium tumefatciens,在7天内平板计数降至0,而水体中镜检细菌总数(AODC)和活菌直接计数(DVC)结果无大变化,说明细菌已变成活的非可培养状态。Micrococcus,flavus 和 Streptococcus faecalis 的可培养菌数也可降至0。Pseudomonas sp.在48小时内由10~5降至10~2cfu/ml,随即升至10~6 cfu/ml 并持续到实验终了(41天)。Bacillus subtilis 在48小时平板计数降至10~2cfu/ml 并维持在该水平至实验结束(38天)。研究结果表明仅用涂布平板法检测多种细菌在水环境中的生存和分布是不合适的。     

白腐菌对培养环境pH的调节及其产漆酶的相关性

研究了不同种属白腐菌多孔菌属C1(Polyporussp.)、侧耳属B2(Pleurotussp.)、香菇属A3(Lentinusedodes)对培养环境pH的调节,及其与菌株产漆酶状况的相关性。结果表明:3株白腐菌均可调节培养液酸化,培养环境的pH可分别由初始的4.5~5.0持续下降至培养结束时3.0~3.5水平,相应C1、B2、A3三者的漆酶合成与分泌在pH值较高(pH 4.5以上)时均表现较弱(酶活分别处于约1 500、200、50 U/mL以下的水平),在pH 3.2~4.5范围内的不同偏酸性条件下则得到较好表达(最高酶活分别达5 000、340、144 U/mL)。统计学分析指出,白腐菌调节环境pH状况与其产漆酶状况之间存在显著或极显著相关性,但不同白腐菌调节培养环境pH的能力之间并不具有显著性差异。     

人胚胎干细胞在3种培养体系中的生长

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells.hESCs)的培养一直是干细胞研究的重要内容.用本实验室独立建系的两株hESCs,建立3种不同的培养体系:小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)做饲养层,永生化人成纤维细胞(immortalized human adult fibroblasts,HAFi)做饲养层,无饲养层条件培养基培养体系(condition medium,CM),观察在3种培养体系中,干细胞的增殖和分化情况.发现3种培养体系中的hESCs都可以表达一致的生物学特性,但也有不同之处,相对于CM干细胞在MEFs和HAFi饲养层体系的分化率低,增殖快;但MEFs来源于鼠类是异源细胞,HAFi虽不舍鼠源性成分却繁殖很慢;无饲养层的体系便于操作,无外源细胞存在.实验所得出的结果可以引导研究人员针对于临床、科研不同的需要,选择最适合的培养体系.     

氧化压力下沙门氏菌可培养性检测及其活的非可培养状态形成情况

【背景】氧化压力会导致细菌进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,菌落形成能力可能受到亚致死损伤的影响。目前对于VBNC态细菌的定量检测是基于活菌数与可培养数的差值,因此可培养数的检测对于VBNC态定量研究很关键,培养基组成不合适可能会造成漏检。【目的】分析培养基组成对氧化压力下亚致死损伤细菌检测的重要影响;探究常见食源性致病菌肠炎沙门氏菌在氧化压力下形成VBNC态的情况。【方法】分别采用Luria-Bertani (LB)、beef peptone yeast (BPY)和Salmonella Shigella (SS)培养基检测并比较肠炎沙门氏菌的可培养数;采用RT-qPCR、荧光染色-激光共聚焦显微镜观测氧化压力下肠炎沙门氏菌形成VBNC态的情况。【结果】非选择性培养基LB和BPY能检出亚致死细菌,SS培养基中牛胆盐导致可培养数减少;肠炎沙门氏菌经53°C过氧化氢处理1.5 h后进入VBNC态的比例显著高于53°C过氧化氢+亚铁离子和过氧化氢+柠檬酸处理(P<0.05)。【结论】在对VBNC态的检测中应选择合适的固体培养基检测可...     

环境中"活的非可培养(VBNC)"细菌的研究进展

1982年徐怀恕等通过对V.cholerae和E.coli存活规律的研究,首次发现并提出了细菌“活的非可培养”状态(Viable but non—culturable state,VBNC),即细菌处于不良环境条件下,其细胞通常缩成球形(最近许多研究中发现还有些细菌表现为体积增大,细胞伸长),用常规方法培养不能使其生长繁殖,但仍然具有代谢活性,在DNA合成抑制剂的作用下,添加一定量的营养物培养时,这些细胞虽然不能分裂,但仍可以伸长生长,证明其仍然存活,并非死亡。处于VBNC状态的细菌,在一定的条件下可以复苏,并具有潜在的致病性,如V.cholerae即通过这种形式实现越冬。至今已有多种细菌进入VBNC状态的报道,许多G^-菌及某些不形成芽胞的G^ 菌在不良环境条件下都可能进入该状态。这些细菌通过进入VBNC状态,得以渡过难关并存活下来,成为细菌的一种特殊存活形式。现在,细菌VBNC状态已作为微生物学的一个全新概念,受到极大的关注,它对传统的微生态学、食品安全、水质监测、菌种保藏及流行病学研究等均提出了新的挑战,也为人们应用基因工程菌的危险性评估提供了新的认识,本文对环境中VBNC细菌的研究进展进行了综述。