微生物VBNC状态形成及复苏机制

99%以上的微生物因处于活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态而无法分离培养。复苏促进因子(resuscitation-promoting factors,Rpfs)是培养获取VBNC菌的最重要突破。结合课题组近十余年从环境功能视角利用Rpf复苏培养VBNC菌的研究,本文在阐述微生物VBNC状态的形成及复苏进展的基础上,从VBNC菌形成及复苏过程出发,探究"探索因子"与群体感应的内在关系。并总结了课题组利用Rpf所复苏培养的具有潜在环境功能的VBNC菌种。本论文将为揭示微生物VBNC状态的形成及复苏机制提供新的思路,并为认识和重新评价Rpf法复苏培养VBNC菌在污染环境微生物修复中的作用提供理论依据。     

活的但非可培养(VBNC) 状态菌的研究进展

VBNC(viable but non-culturable)是指处于"活的但非可培养"状态的微生物,此微生物体的细胞仍有代谢活性,但用常规方法无法分离培养.本文阐述了VBNC状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望.并报道了我们在十余年间针对生态环境中处于VBNC状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果,拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据.     

氧化胁迫诱导苍白杆菌JP1形成VBNC状态及其特征

石油降解菌在各种有害环境因素作用下会进入活的非可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态，从而影响其生长及石油降解率。为了研究有害环境因素对石油降解菌生长及石油降解率的影响，采用分光光度法、荧光染色-激光共聚焦显微镜观测H₂O₂胁迫下苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)JP1细胞的生长及VBNC状态形成情况。结果表明，不同浓度H₂O₂对其生长有一定抑制作用，当培养液中H₂O₂浓度为75.0 mmol/L时，可有效抑制苍白杆菌JP1生长，处理12 h后苍白杆菌JP1进入VBNC状态。VBNC状态的苍白杆菌JP1细胞缩小变成球体，周质间隙增大；在适宜条件下，VBNC状态苍白杆菌JP1能够复苏为可培养状态，添加丙酮酸钠能够促进VBNC状态细菌细胞的复苏。复苏后的苍白杆菌RJP1具有良好的环境适应性和石油降解能力，为石油污染生物修复的菌种筛选及应用提供了新的策略。     

致病微生物应对环境胁迫形成的VBNC状态及其对风险评估的潜在影响

防止食源性致病菌对食品的污染是保障食品安全的重要策略之一。研究表明,环境胁迫下微生物可能形成"活的不可培养状态"(VBNC状态),成为食品安全的潜在风险。本文对致病微生物VBNC状态的最近发现进行了归纳和总结,重点分析了不同环境胁迫(包括自然胁迫以及食品加工和保藏过程中的各种胁迫等)因素下菌体进入VBNC状态的普遍性、诱导条件和生理特点等,并对现行的基于微生物可培养性而建立起来的常规检测方法的局限性及其对食品安全风险评估潜在影响进行了讨论。     

细菌有活力但不可培养状态及其机制研究进展

有活力但不可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态是细菌遭遇逆境时进入的一种特殊状态,该状态下的菌体在条件适宜时可复苏并恢复其致病性,被认为是细菌躲避不良环境的一种生存策略。VBNC状态菌体对人类医学和工农业生产具有巨大的潜在威胁,开展关于VBNC状态的检测及诱导、复苏及其机制研究可为减少或避免该状态细菌的危害提供理论基础。本文简要综述了细菌VBNC状态在诱导、复苏及致病性等方面的研究进展,并结合本实验室及国内外相关团队近年来在植物病原细菌VBNC状态研究中的结果,详细总结了VBNC状态细菌的形成和复苏机制,对植物病原细菌在环境胁迫下的存活机制、病害田间初侵染来源分析及VBNC状态菌体在病害循环中的作用等相关研究具有重要参考意义。     

环境中"活的非可培养(VBNC)"细菌的研究进展

1982年徐怀恕等通过对V.cholerae和E.coli存活规律的研究,首次发现并提出了细菌“活的非可培养”状态(Viable but non—culturable state,VBNC),即细菌处于不良环境条件下,其细胞通常缩成球形(最近许多研究中发现还有些细菌表现为体积增大,细胞伸长),用常规方法培养不能使其生长繁殖,但仍然具有代谢活性,在DNA合成抑制剂的作用下,添加一定量的营养物培养时,这些细胞虽然不能分裂,但仍可以伸长生长,证明其仍然存活,并非死亡。处于VBNC状态的细菌,在一定的条件下可以复苏,并具有潜在的致病性,如V.cholerae即通过这种形式实现越冬。至今已有多种细菌进入VBNC状态的报道,许多G^-菌及某些不形成芽胞的G^ 菌在不良环境条件下都可能进入该状态。这些细菌通过进入VBNC状态,得以渡过难关并存活下来,成为细菌的一种特殊存活形式。现在,细菌VBNC状态已作为微生物学的一个全新概念,受到极大的关注,它对传统的微生态学、食品安全、水质监测、菌种保藏及流行病学研究等均提出了新的挑战,也为人们应用基因工程菌的危险性评估提供了新的认识,本文对环境中VBNC细菌的研究进展进行了综述。     

低温寡营养条件下副溶血弧菌形成活的非可培养状态及其复苏研究

为研究在低温寡营养条件下副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能否进入活的非可培养状态(VBNC),将浓度为1×1010CFU/mL的副溶血弧菌HW799在陈海水中4℃保存,每隔5天取样分别用吖啶橙染色荧光显微镜直接计数法(AODC)、活菌直接计数法(DVC)和涂布平板法(PC)测定细菌总数、活细菌数和可培养细菌数.在第30天时总细菌数基本不变,仍保持在109CFU/mL,活菌数为106CFU/mL,比总菌数低了约三个数量级,可培养细菌数为零,表明绝大部分副溶血弧菌HW799进入了VBNC状态;用扫描电镜、流式细胞仪对副溶血弧菌HW799活的非可培养状态、正常状态以及复苏后的细胞形态的研究表明进入VBNC状态后副溶血弧菌HW799形状变为球状,体积比正常状态明显变小,活细胞数也略有减少;采用在培养液中添加营养物质升温培养的方法,使VBNC状态的副溶血弧菌细胞在48h内复苏为可培养状态,复苏后的副溶血弧菌HW799与正常状态的细菌形态相似.     

广西蚕沙细菌组成多样性解析和VBNC菌群的发掘

【目的】解析广西蚕沙中细菌群落组成与多样性,为蚕沙中菌种资源发掘和蚕沙的综合利用提供科学依据。【方法】通过高通量测序技术研究细菌群落组成特征,同时利用常规稀释涂布平板法和基于复苏促进因子(Rpf)的MPN培养系统解析并筛选蚕沙中可培养和活的非可培养(VBNC)状态的优势菌群,并经16SrRNA基因测序对筛选得到的菌株作初步分类鉴定。【结果】高通量测序表明,广西蚕沙样品中细菌归属于10个门、18个纲、27个目、57个科、96个属,其中4个属的丰度达1%以上,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌属(Enterobacter);通过稀释涂布平板法共获得14个属的33株可培养细菌,其中4个属(Citrobacter、Weissella、Chitinophaga、Pseudoclavibacter)在高通量测序中未被检测到;而在MPN培养系统中,基于复苏促进因子的处理组细菌总数最大检出丰度提高了100倍,并从中共检出21株对Rpf敏感的VBNC菌株,其中6个属(Paenibacillus、Caulobacter、Roseomonas、Pantoea、Erwinia、Acinetobacter)为传统分离法中未能获得的菌属,2个属(Paenibacillus和Caulobacter)在高通量测序中未被检测到。【结论】蚕沙细菌多样性丰富,不同方法解析蚕沙细菌组成多样性存在一定差异,而且通过添加Rpf首次发现了蚕沙中存在大量过去未被认知的VBNC状态细菌,其中从16S rRNA基因序列同源性推测有3个VBNC菌株为潜在新种。此研究结果为深入挖掘蚕沙中微生物资源提供了新的视角与途径,为蚕沙的综合处理提供了研究基础。     

混合菌群YC-BJ1对有机磷阻燃剂的降解及16S rRNA基因多样性分析

作为阻燃剂,有机磷酸酯广泛应用于工业制品和人类生活用品中,是一种全球性的环境污染物,因其具有特殊的理化性质,自然条件下很难水解。因此,对有机磷酸酯的微生物降解成了当下的研究热点。通过持续逐级富集,从北京某垃圾处理厂渗透液中富集到一个混合菌群(编号为YC-BJ1),并在降解特性、底物谱以及物种组成多样性3个方面对其进行定性鉴定。该菌群能够高效降解磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate, TPhP)和磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate, TCrP),培养4 d能够实现对100 mg/L TPhP和TCrP的基本降解,降解率分别为99.8%和91.9%。降解特性研究发现,该混合菌群具有出色的环境适应能力,能够在较宽的环境条件下(温度15–40℃,pH 5.0–12.0, 0%–4%盐)保持对TPhP的降解能力。底物谱分析发现,混合菌群YC-BJ1能够降解部分含氯有机磷阻燃剂,培养4d,对磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(Tris(1,3-dichloroisopropyl)phosphate,TDCPP)和磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP)的降解率分别为16.5%和22.0%。16S rRNA基因物种多样性分析发现,混合菌群YC-BJ1中物种丰度最高的3个菌属分别是生丝微菌属Hyphomicrobium (38.80%)、金黄杆菌属Chryseobacterium (17.57%)和鞘氨醇盒菌属Sphingopyxis (17.46%)。与目前已报道的有机磷阻燃剂降解菌和菌群相比,混合菌群在降解效率和环境适应能力方面都具有极大的优势,有较广泛的应用空间。高效降解菌群的富集能够为有机磷阻燃剂的降解及其环境污染生物修复提供微生物资源,并为其降解机理的探索提供支持。     

开发未可培养微生物技术的研究进展

细菌的"活的非可培养状态"(VBNC, viable but nonculturable)发现于20世纪80年代,处于此状态的细菌不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力,而且具有与原菌相似的致病性,成为可以逃避检测的"隐性"传染源,对周围的环境及人类安全构成潜在威胁.作为公认的未可培养微生物,它一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一.现代分子生物学技术和基因组学的深入研究,为开发环境中的未可培养微生物提供了新的研究方法和机遇.其中遗传指纹图谱技术、宏基因组技术显示出一定的优势,同时,随着各种细菌的非可培养状态的实验室模型已日臻成熟,这为开发和利用未可培养微生物资源提供了新的研究思路.     

细菌“活的不可培养状态”的生态意义及研究进展

"活的不可培养(VBNC)"状态是细菌在不良条件下的一种生存方式.VBNC状态作为细菌的一种生理状态,对传统微生物学产生了深远的影响.进入VBNC状态的细胞发生了一系列变化,无法继续用常规培养方法检测,在医学健康,环境科学等领域产生了巨大的影响,改进检测方法具有重要的意义.本文介绍了进入VBNC状态细菌在DNA、蛋白质组成等方面发生的变化,复苏过程.同时还介绍了VBNC状态的最新检测方法,最后对VBNC状态未来的研究方法进行了讨论.     

开发未可培养微生物技术的研究进展

细菌的“活的非可培养状态”(VBNC, viable but nonculturable)发现于20世纪80年代, 处于此状态的细菌不但丧失了在培养基上生长繁殖的能力, 而且具有与原菌相似的致病性, 成为可以逃避检测的“隐性”传染源, 对周围的环境及人类安全构成潜在威胁。作为公认的未可培养微生物, 它一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。现代分子生物学技术和基因组学的深入研究, 为开发环境中的未可培养微生物提供了新的研究方法和机遇。其中遗传指纹图谱技术、宏基因组技术显示出一定的优势, 同时, 随着各种细菌的非可培养状态的实验室模型已日臻成熟, 这为开发和利用未可培养微生物资源提供了新的研究思路。     

培养法和免培养法联合检测油藏环境烃降解菌和产甲烷菌群多样性

烃降解菌和产甲烷菌是油藏环境微生物生态系统中重要的功能菌群, 采用DGGE和FISH方法分析了不同油藏样品中两类菌群的多样性和产甲烷活性。DGGE结果表明, 不同水样的alkB基因多样性相差较大, 而且注水井条带明显多于采油井。FISH结果表明, 油藏水样中产甲烷菌含量明显高于烃降解菌, 且两者空间分布的位置较近; 说明油藏环境中烃降解菌和产甲烷菌结成一定的相互关系。富集培养表明, 胜利油田产出液接种物培养130 d后, 石油烃降解率达到50%以上, 产甲烷的最大速率达到1.57×10^?2 mmol/(L?d)。利用分子生物学方法分析油藏环境功能菌群的多样性, 可以为开展微生物采油技术的应用提供有用信息。     

油田含聚合物污水微生物处理初步研究

对油田日益增多的并且对环境造成潜在危害的而现有污水处理工艺难于处理的含聚合物污水进行微生物处理初步研究。结果表明,从油田污水污泥中分离得到的七株聚丙烯酰胺(PAM)降解菌在合适的营养条件下协同作用,对大港油田的含PAM的污水具有较好的处理效果。经过3d的处理,微生物菌群将补充了磷和氮的污水的COD降低了87.7%;经过18d的处理,微生物菌群将补充了磷的污水的COD由13499mg.L-1降低为283 mg.L-1,降低幅度达到了97.9%。因而这7株PAM降解菌对含PAM污水处理具有很好的应用前景。     

萘的微生物降解研究进展

萘是一类具有严重"三致"效应(致癌、致畸、致突变)的多环芳烃类有机化合物,严重威胁人类健康。萘的微生物降解由于具有操作简单、经济实用及不产生二次污染等优点,近年来成为治理萘污染的主要手段之一。对不同环境中筛选的萘降解菌的系统生物学分类、培养条件对萘微生物降解效率的影响、萘的微生物降解途径、关键基因和酶及其实际应用方面进行了综述,指出了目前萘微生物降解研究领域存在的问题,并对未来的研究方向做出了展望。     

空肠弯曲菌活而不可培养状态的产毒素能力及毒素基因表达的检测

目的 通过诱导空肠弯曲菌进入活的不可培养(VBNC)状态建立细胞学模型,用VeroE6细胞和HeLa细胞检测空肠弯曲菌产细胞膨胀性肠毒素(cytotoxic distendingtoxin,CDT)能力的改变,并在RNA水平上进一步验证毒素的表达。方法 采用4℃冷藏及-70℃冷冻的方法诱导空肠弯曲菌进入VBNC状态,利用细胞总数计算、活细胞染色计数及可培养细胞计数间接确证VBNC状态细菌的存在,细胞对于VBNC状态下的细菌仍然敏感,并用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实空肠弯曲菌毒素基因的表达。结果 3种不同状态的细胞计数结果表明存活细胞进入了VBNC状态,细菌经4℃冷藏及-70℃冷冻后数量减少约1个数量级,在冷冻前,细菌对细胞毒性较强,72h时70%以上细胞凋亡,冷冻后的VBNC状态细菌对VeroE6和HeLa细胞的生长仍有影响,72h时约有40%细胞进入凋亡状态。结论 低温、贫养条件下空肠弯曲菌可进入VBNC状态,用常规传统的羊血平板培养基仅能使不到10%的空肠弯曲菌复苏生长,从而可以检测,在VBNC状态时,空肠弯曲菌产毒素能力改变较大,远远低于正常状态,但仍具备产毒素的能力,也从RNA水平实验得到证实。     

煤矿污染土壤降解苯并(a)芘微生物多样性及降解能力研究

以苯并(a)芘(50 mg/L)为唯一碳源,对新疆芦草沟煤矿开采区土壤微生物进行3代胁迫培养(每代60 d);采用PCR-DGGE方法了解不同污染程度土样中降解苯并(a)芘的微生物类群和多样性特点;利用高效液相色谱(HPLC)测定胁迫培养每代培养物混合菌群对苯并(a)芘的降解能力。PCR-DGGE结果显示:不同污染程度原始样品与苯并(a)芘胁迫培养第3代培养物的微生物香浓指数(H)、丰度(S)和均匀度(E)有所不同,其中重度污染培养物降解苯并(a)芘的微生物类群最丰富。对优势条带进行克隆,其主要归属于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)。经HPLC检测发现重度污染样品中的群体微生物对苯并(a)芘的降解率明显高于轻度和中度污染样品,达到78.4%。研究表明新疆芦草沟煤矿开采区污染的土壤中可能蕴藏着降解苯并(a)芘的微生物资源。     

活的但不可培养的微生物

Colwell实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念,他们发现将霍乱弧菌和大肠埃希菌(简称大肠杆菌)转到不含营养物质的盐水中,经长时间的低温保存,细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常实验室培养条件下不能生长产生菌落的状态,称为活的但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态[1].     

一株海草沉积物菲降解菌的筛选、鉴定和降解特性

【背景】多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类高毒性的有机污染物,在海洋环境尤其是沿海环境中广泛分布。海草床生态系统作为沿海环境的重要组成部分,深受环境污染等人类活动的影响而处于严重衰退的状态。微生物修复是修复环境中多环芳烃污染的重要途径,具有经济简便、环境友好和无二次污染等特点。【目的】从深圳市大亚湾的海草床沉积物中筛选获得高效多环芳烃降解菌,并分析其降解特性,从而探究海草床生态系统中多环芳烃污染物的微生物修复可行性。【方法】以多环芳烃菲为唯一碳源从海草床沉积物样品中筛选菌株,再通过形态学观察、生理生化实验和16SrRNA基因序列对筛选的菌株进行鉴定,并利用特定引物扩增多环芳烃降解的功能基因——双加氧酶(nidA)基因,最后通过培养实验分析该菌株对菲的降解特性。【结果】筛选出一株高效降解菲的菌株SCSIO 43702,经鉴定为玫瑰杆菌属(Roseovarius)的潜在新菌,并成功扩增得到双加氧酶相似(nidA like)基因;培养实验结果表明,玫瑰杆菌SCSIO 43702在10 d内对100 mg/L菲的降解率最高可达96%,而且其对菲的最适降解条件为:温度30°C、pH值7.5和8.0、盐度3%。【结论】玫瑰杆菌SCSIO 43702凭借其良好的菲降解能力和较强的环境适应性,具有进一步被开发为微生物菌剂以用于多环芳烃污染修复的巨大潜力,为海草床生态系统中多环芳烃污染的微生物修复研究提供了理论依据和可利用的微生物资源。     

油藏样本潜在核心功能微生物群的宏基因组挖掘

【背景】识别出具有驱油功能的内源性微生物群是当前设计高效微生物采油技术的迫切需求。【目的】通过宏基因组分析找出原位油藏微生物中具有产酸/产气功能的潜在核心微生物群。【方法】利用室内模拟体系,对原位油藏微生物进行有机营养(从有氧到无氧)的激活,运用生物信息、多元统计分析以及网络分析等方法,寻找潜在内源性核心功能微生物群。【结果】有机营养激活了原位油藏样本中以Bacillus licheniformis为核心的产酸菌群(包括Coprothermobacter proteolyticus、Marinobacterspp.、Anaerobaculumhydrogeniformans和Petrotogamobilis),该菌群具有以丙酮酸/乙酰辅酶A为原料发酵乳酸、乙酸以及甲酸的功能;激活了以Enterococcus faecium为核心的产气菌群(包括Shinella zoogloeoides、Paracoccus denitrificans、Paracoccus spp.和Enterobacter cloacae),该菌群具备以(亚)硝酸盐、(亚)硫酸盐、石油烃为原料生产含氮/硫/碳等气体的能力。2个核心菌群内部分菌同时具有产酸和产气通路基因,激活过程中2个菌群的丰度变化呈负相关关系。【结论】利用有机营养激活体系及宏基因组测序分析技术,筛选出了油藏样本中具备产酸、产气能力的核心功能菌群,为后续进一步的功能菌株研究提供了潜在靶标及功能指向。