人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .     

人同源框基因Lhx4 cDNA序列的获得,染色体定位和基因组分析

Lhx4基因是LIM同源框基因家族的一员 ,它在运动神经元的发育过程中发挥着重要的作用 .从人脊髓cDNA文库中筛选到了 1个人源性Lhx4基因的cDNA全长序列 ,它与鼠源性的Lhx4基因的cDNA序列有 92 %同源性 .它的基因被定位在 1号染色体 1q 2 4 .1- 1q 2 4 .3的位置 ,并包含有 6个外显子 .其中同源框结构域由外显子 4和 5表达 ,LIM结构域 1由外显子 2表达 ,LIM结构域2由外显子 3表达 .     

雄激素受体辅助调节因子267-a的相互作用蛋白——死亡受体6的鉴定

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-a(androgenreceptor-associatedcoregulator267-a,ARA267-a)的功能,以含有编码ARA267-a中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒,采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质.在筛选文库的阳性克隆中,经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对,发现死亡受体-6(deathreceptor-6,DR6)是ARA267--PHD-SET的相互作用蛋白之一.通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-a的PHD-SET结构域相结合.DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一,它的胞内区含有死亡结构域,参与细胞凋亡信号的传导.这个研究结果提示:有ARA267-a参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-a和DR6的相互作用而产生交叉联系.     

人重组白细胞介素12在CHO细胞中的表达

将人白细胞介素12（interleukin 12, IL-12）两条链p35及p40全长cDNA分别亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了pcDNA3/p35a,pcDNA3/p40a,pcDNA3/p35b,pcDNA3/p40b四种真核细胞重组表达质粒,利用磷酸钙共沉淀法转染中国苍鼠卵巢(CHO)细胞. 通过对阳性克隆的筛选鉴定,获得了稳定表达人IL-12的CHO细胞株,活性最高的一株表达量为105 U/ml.此细胞株经半年的传代培养,能够稳定地分泌IL-12.结果显示：IL-12在CHO细胞中的稳定表达受到重组质粒结构、DNA整合、mRNA转录、蛋白质翻译等多因素的影响,IL-12两个亚基在CHO细胞中的共同表达是产生有生物活性IL-12的基础.     

雄激素受体辅助调节因子267-α的相互作用蛋白

为了研究新发现的雄激素受体辅助调节因子267-α (androgen receptor-associated coregulator 267-α, ARA267-α)的功能, 以含有编码ARA267-α中4个PHD和1个SET结构域的cDNA片段构建诱饵重组表达质粒, 采用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质. 在筛选文库的阳性克隆中, 经过DNA测序和在GenBank中的同源核苷酸序列比对, 发现死亡受体-6(death receptor-6, DR6)是ARA267-α-PHD-SET的相互作用蛋白之一. 通过再次酵母双杂交、体外免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证实DR6的胞内区可以与ARA267-α的PHD-SET结构域相结合. DR6是肿瘤坏死因子受体家族成员之一, 它的胞内区含有死亡结构域, 参与细胞凋亡信号的传导. 这个研究结果提示: 有ARA267-α参与的雄激素-雄激素受体通路与有DR6参与的细胞凋亡通路之间可能通过ARA267-α和DR6的相互作用而产生交叉联系.     

草鱼转铁蛋白基因的克隆及其组织表达

转铁蛋白(Transferrin,Tf)功能广泛,不仅参与机体内铁离子的运输和代谢,还在细胞呼吸、细胞生长和增殖中起重要作用,而且它具有抗菌杀菌的功能。研究从草鱼肝肾全长cDNA文库中克隆得到草鱼转铁蛋白基因(CtTf),该基因全长cDNA5′非编码区包含31bp,最大开放阅读框为2025bp,编码674个氨基酸,3′非编码区为266bp。研究使用了Signal P、SMART等在线软件对草鱼转铁蛋白全长cDNA的分子特征进行预测,结果显示CtTf编码的蛋白质N-端有1个由15个氨基酸残基组成的信号肽,第24-334个和第338-665个氨基酸为2个保守的结构域,二者同源率为31%。与其他物种的转铁蛋白类似,草鱼转铁蛋白每个结构域包含4个铁离子结合位点,它们在两个结构域中的位置相对保守,除了这8个铁离子结合位点外,还存在多个完全保守的氨基酸位点。草鱼转铁蛋白与人及其他物种有很高的同源性,与其他鲤科鱼类的同源性为65%-73%;与海洋鱼类同源性为43%-50%;与两栖、爬行、鸟类、哺乳类的同源性为40%-42%。系统进化树也显示草鱼转铁蛋白基因与斑马鱼和鲤鱼的亲缘关系最近。RT-PCR的实验结果表明,在草鱼肝、肠、肾、脾、心、肌肉、鳃和脑8种组织中,草鱼转铁蛋白基因在肝中的表达量最高,其次为脾和肠,在鳃和脑中有痕量表达。       

L1CAM胞内区相互作用蛋白的筛选与鉴定

L1细胞粘附分子(L1cell adhesion molecular,L1CAM)属于神经细胞粘附分子,是属于免疫球蛋白超家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白.L1主要在神经系统中表达,参与神经系统发育,学习记忆等重要过程作用.L1的胞内区可能参与信号转导,对于L1的功能非常重要,为探讨L1胞内区信号转导的分子机制,以L1胞内区为诱饵运用酵母双杂交技术在人脑cDNA文库中筛选其结合蛋白,挑选阳性克隆,进行DNA序列分析和同源检索,阳性克隆编码几个不同的蛋白质,其中一个候选蛋白为PAX6转录因子.为进一步验证L1胞内区和PAX6的相互作用,克隆其基因到表达质粒共转染COS-7细胞,免疫共沉淀证实了L1胞内区和PAX6的相互作用,提示L1胞内区可能参与转录调节,为深入探讨其功能提供了重要线索.     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3).将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过脂质体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆.经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆,细胞测活结果表明,表达产物具有抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性.鸡胚测活结果表明,CHO细胞表达的r Flt-1n3能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成.     

受NaCl诱导的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶cDNA的克隆及其在烟草中的表达

采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术, 获得了盐藻(Dunaliella salina)受诱导表达的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶全长cDNA (DsALDP). 蛋白质序列分析发现, DsALDP与许多植物叶绿体的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(AldP)具有较高的同源性(66%~73%). 系统进化分析进一步证明DsALDP与藻类的AldP亲缘关系最近. 就表达谱而言, DsALDP是NaCl诱导下新表达的转录本, 其表达水平随诱导时间的不同而呈显著变化. 筛选的DsALDP cDNA构建到双元载体pBI121并导入农杆菌用以转化烟草, 对4个T₁代转基因植株进行Southern检测, 证明DsALDP已整合入转基因植株的基因组. RT-PCR分析显示DsALDP在这些植株中均得到有效表达. 生物测试表明, T₁-1, T₁-2和T₁-3植株在100~200 mmol/L NaCl下仍保持醛缩酶活性, 且其脯氨酸含量均有不同程度的升高.     

恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达

目的对恒河猴tPA编码区cDNA进行测序和表达.方法采用RT-PCR方法从恒河猴淋巴细胞中扩增tPA基因,将获得的cDNA克隆于T载体,序列确定后再克隆至真核表达载体.结果测序结果表明恒河猴tPAcDNA编码区与人tPAcDNA编码区的核苷酸序列同源性为96%,由此所推导的氨基酸序列的同源性为97.5%.随后将恒河猴tPAcDNA克隆于真核表达载体,转染CHO细胞后成功表达出了有活性的tPA.培养上清检测结果显示其活性约为50?U/ml,略低于人tPA在CHO细胞中表达产物的活性.结论本研究首次报道了恒河猴tPA基因编码区的全长cDNA序列并获得了有活性的恒河猴tPA真核表达产物.将为进一步比较灵长类动物间tPA的生物学特性奠定基础.     

亚洲玉米螟中stuxnet基因的时空表达与功能分析

[目的]本研究旨在鉴定亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis中stuxnet (stx)同源基因Ofstuxnet(Ofstx),进一步明确ofstx基因的功能,探索基于表观遗传调控的害虫防治新策略.[方法]基于反转录技术获取亚洲玉米螟ofstx基因的全长cDNA序列,进行cDNA全长测序,分析其生物学信息;分别提取亚洲玉米螟不同发育阶段(3-5龄期幼虫)及不同组织(头、中肠、脂肪体)中RNA,并通过RT-qPCR技术检测ofstx基因在亚洲玉米螟不同发育阶段及不同组织中的相对表达量.[结果]亚洲玉米螟ofstx基因全长2112 bp,编码蛋白质含703个氨基酸,预测分子量76.98 ku,等电点8.30.比对其它物种Stx同源蛋白氨基酸序列发现其都含有UBL保守结构域.系统发育树分析发现与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda所属的夜蛾科同源性较高.qPCR结果显示ofStx在脑内相对表达量最高,在3-5龄幼虫中,4龄幼虫体内总体表达量最高.[结论]ofstx基因主要在亚洲玉米螟脑内表达,幼虫阶段的第4龄期相较第3、第5龄期相对表达高,可能参与调控昆虫生长发育,具体功能有待进一步研究.     

GPI锚固型Met-RANTES真核表达载体的构建和表达

目的：在仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中高效表达糖基磷脂酰肌醇（GPI） 锚定修饰的Met-RANTES融合蛋白,以研制新型免疫抑制分子GPI锚固型 Met-RANTES。方法：构建真核表达载体PEF/GPI-Met-RANTES,利用电转化法转染CHO-DHFRˉ细胞,氨甲喋呤（MTX）筛选抗性克隆。用流式细胞仪、细胞免疫荧光和免疫金标记电镜检测细胞膜上 GPI 锚固型Met-RANTES融合蛋白的表达情况。结果：构建了阅读框完整的 GPI 锚固型Met-RANTES 嵌合分子,经测序是正确的,并在CHO-DHFRˉ细胞膜上稳定表达。结论：在CHO 细胞表面高效表达GPI修饰的Met-RANTES融合蛋白,GPI 锚固型Met-RANTES分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中,抑制移植排斥反应。     

人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达

本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体, 稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-I cDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35 cDNA, 重叠PCR法连接2个片段, 并克隆到IgG4(Fc)- pOptiVEC?-TOPO?载体上,对新构建的IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定; 脂质体法转染CHO/DG44细胞; RT-PCR检测转染结果, 采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞, 对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate, MTX)的加压筛选, ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清, 免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4 (Fc) pOptiVEC?-TOPO?表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆; SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带; 该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。     

幽门螺杆菌毒素蛋白CagA诱导的蛋白的差异表达分析及其基因在胃癌组织中的表达

为了研究胃癌细胞中幽门螺杆菌(Hp)毒素蛋白CagA诱导的蛋白差异表达及其基因在人胃癌组织中的表达,用Hp感染胃癌细胞系SGC 7901和AGS及用含CagA基因的表达载体稳定转染SGC 7901细胞, 构建3组实验模型.提取各组细胞的总蛋白进行双向凝胶电泳,筛选3组重叠的差异表达蛋白质斑点进行质谱鉴定.共获得135个差异表达的蛋白质,其中上调蛋白质73个,下调蛋白质62个. 鉴定出10个差异表达蛋白质, 其中有6个差异表达蛋白是首次发现,它们主要参与细胞的能量代谢和信号转导等.最后定量检测了这10个差异表达蛋白基因在人胃癌组织中的表达, 发现有4个基因高表达和1个基因低表达. 本结果将为研究幽门螺杆菌感染引起胃癌的分子机制提供新的线索.     

人伴肌动蛋白相关锚定蛋白基因cDNA的克隆与功能分析

小鼠伴肌动蛋白相关锚定蛋白(N-RAP)是已知的与肌纤维生成有关的细胞骨架蛋白,但是,与此对应的人类N-RAP基因的cDNA序列及其功能一直是未知的.为了明确N-RAP基因在人类中所起的作用,利用生物信息学分析工具和分子生物学技术,成功地克隆了人N-RAP基因.人N-RAP基因cDNA序列含有一个5 088 bp的开放读码框,与小鼠N-RAP基因有86%的相似性.染色体定位分析表明,人N-RAP基因定位于10q25～q26之间,编码区由41个外显子组成,与HABP2和CASP7紧密连锁.电子表达谱分析表明,肌肉、心脏、脑、脊髓和前列腺有人N-RAP基因不同长度的cDNA序列.人N-RAP与小鼠N-RAP蛋白质序列有88%的相似性,与人Nebulin有约63%的相似性,与小鼠Nebulin有约59%的相似性.结构域分析发现,N端为LIM结构域,从第170位氨基酸开始,连续出现40个Nebulin相关重复序列.RT-PCR实验表明,人N-RAP基因在成人脑、骨骼肌和心脏组织中都有表达,在骨髓中不表达.亚细胞定位研究显示,人N-RAP基因表达于胞浆.基于序列相似性、结构域分析、表达谱分析和亚细胞定位研究,可以推测人N-RAP与小鼠N-RAP同属Nebulin家族,具有类似的功能.     

EDAG—1，一种与造血调控密切相关新基因的分离和确认

以代表性差异显示分析技术（RDA）获得一种在人胎肝组织中高丰度表达的胚胎发育相关基因1（embry-onic develop associated gene1,EDAG-1）,经筛选cDNA文库及5′末端cDNA快速扩增技术（rapid amplification of cDNA 5′end,5′RACE）获得其全长为2166bp的cDNA。该基因含编码484个氨基酸组成蛋白质的ORF,Blast检索表明编码蛋白质不含任何已知蛋白质功能结构域,与小鼠Hemogen及大鼠RP59基因同源。其mRNA3′端非释译区序列含2拷贝AUUUA结构,表明该基因mRNA稳定性差。体外翻译证明该基因编码蛋白质分子量为55.3kD,与理论预测值一致。Northern杂交及PCR检测表明该基因主要表达在成人在及胚胎胪组织,在K562和MO7e两株人髓性白血病细胞系中也有较高丰度表达。氯高铁血红素及红细胞生成素EPO（erythropoietin）诱导K562细胞向红系分化过程中,EDAG－1的表达随细胞的分化迅速下调;这些结果提示EDAG－1可能是一种与造血细胞分化调控密切相关的新基因。     

小立碗藓冷驯化相关基因Pp-LIM only A的克隆与表达

植物经历冷驯化后抗冻能力会有所提高.利用cDNA-AFLP方法从经过0℃冷驯化处理的小立碗藓中筛选到差异表达的Pp-LIM only A基因片段.cDNA和基因序列比较分析表明此基因含有7个内含子和8个外显子,编码由345个氨基酸残基组成的蛋白质,其中只含有一个LIM结构域,与动物蛋白质PDZ/LIM家族有很高的同源性,推测是一种新的植物LIM蛋白.实时定量PCR分析显示其在冷驯化6 h后表达量即开始明显增加,并随着冷驯化时间的延长表达量大幅度提高.Pp-LIM only A蛋白可能通过LIM结构域对细胞骨架的作用而影响了细胞膜的稳定性,本研究对其在抗冻中的作用作了进一步讨论.     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

人类Cornulin蛋白S100结构域钙依赖的多聚化能有效减少细胞的损伤

在哺乳动物中发现一类新的能够抵制环境压力和保持组织完整性的应激蛋白.含有S100钙结合结构域的Cornulin(CRNN)是这类蛋白质之一,它在人类食管鳞状上皮细胞中高表达,而在食管鳞状上皮细胞癌中却低表达,它能抑制脱氧胆酸诱导的细胞损伤.S100结构域在CRNN的功能上具有重要作用.为了进一步探讨CRNN S100结构域的生物学特性,克隆、表达、纯化了该结构域,证明其折叠正确,适合用于生物物理和生物化学特性的研究.更为重要的是,通过核磁共振、凝胶过滤层析、超速离心、质谱和蛋白质交联分析,发现S100结构域具有钙依赖的多聚性质,而多聚体的形成更有利于保护细胞免受脱氧胆酸和乙醇的损伤.上述结果表明,S100结构域是CRNN发挥功能的关键结构域,它可以通过多聚化更好地保护细胞.该工作将进一步揭示S100结构域的生物学功能.