人白介素6受体功能区片段在E.coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ和ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右,重组蛋白主要包涵体形     

人白介素6受体功能区片段在E．coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ的ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３。重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＬ－６Ｒ的抗原性。     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

小麦黄花叶病毒RNA228kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据小麦黄花叶病毒（ Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ） 核苷酸序列测定结果,将 Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ２ 上的２８ ｋ Ｄａ 蛋白基因克隆到ｐ Ｅ Ｔ１１ａ 上,构建了原核表达载体ｐ Ｅ２８３９ 。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明,经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,２８ ｋ Ｄａ蛋白基因在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）ｐ Ｌｙｓ Ｓ 中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒 Ｒ Ｎ Ａ２ 蛋白特异性抗血清。     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

破伤风毒素C部分的克隆及在大肠杆菌中的表达

用ＣＲ方法从破伤风杆菌基因组ＤＮＡ上坟增出破伤风毒素Ｃ部分（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ,ＴＴＣ）,经测序其基因片段由１３５６ｂｐ组成,可编码４５１个氨基酸残基的多肽。将其插入原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）中,并在大肠杆力ＢＬ２１９ＤＥ３）中表达,其表达量占可溶性总蛋白质的８．２％;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和免疫印迹分析表明,ＴＴＣ基因（该基因ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＦ１５４８２）表     

人GRY-RBP基因的表达及其RNA结合活性的初步鉴定

ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白在基因的转录后调控中起着重要作用．人ＧＲＹ－ＲＢＰ 是我们实验室最近克隆的一个新的全长ｃＤＮＡ,编码一个ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白．ＧＲＹ－ＲＢＰ 的全编码区用ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＥＴ３０ａ＋ 表达载体中,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得了高效表达,表达的ＧＲＹ－ＲＢＰ重组蛋白占细菌总蛋白的２１％ ．利用融合在ＧＲＹ－ＲＢＰＮ 端的Ｈｉｓ．Ｔａｇ,采取亲和层析的方法纯化了表达的重组蛋白．为了检测ＧＲＹ－ＲＢＰ的ＲＮＡ 结合活性及其所结合的ＲＮＡ 性质,将表达的蛋白与ｐｏｌｙ（Ａ）－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ结合,发现ＧＲＹ－ＲＢＰ能与ｐｏｌｙＡ （Ａ）结合,结合活性能被可溶性的ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）减弱．改变ＮａＣｌ浓度和加入不同浓度的酵母ｔＲＮＡ竞争物后,ｐｏｌｙ（Ａ）结合活性不变．     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

狂犬病毒aG株糖蛋白在pET原核系统中的表达及纯化

在狂犬病的临床诊断和基础研究中都迫切需要大量纯度高且价廉的狂犬病毒糖蛋白抗原。本文应用带有Ｈｉｓ６尾的ｐＥＴ原核表达系统对狂犬病毒（ＲＶ）ａＧ株的糖蛋白（ＧＰ）进行表达和纯化。构建的融合表达载体ｐＥＴ－ａＧ１和ｐＥＴ－ａＧ２（－５７ｂｐ）分别含有ＲＶａＧ株ＧＰ基因的全序列及删除了为ＧＰ信号肽编码的５８个碱基的序列。用ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接ＥＬＩＳＡ检测都证明表达产物为ＲＶＧＰ,且位于菌体中的包涵体内。经固定化金属螯合层析（ＩＭＡＣ）提纯,ｐＥＴ－ａＧ１表达产物有较高的特异性和纯度,可用作测定ＲＶＧＰ抗体的免疫诊断试剂。     

HIV—1gp41基因的高效表达及表达产物的纯化

为了获得高效表达的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）ｇｐ４１蛋白,从而为ＨＩＶ１基因工程诊断抗原的国产化打下基础,用ＰＣＲ的方法从ＨＩＶ１全基因序列中扩增出编码ｇｐ４１Ｎ端的６９０ｂｐ片段。经酶切后,克隆到ｐＥＴ２８ａ载体中,再将重组质粒转化到表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导,高效表达出ｇｐ４１蛋白。间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实,该表达产物具有良好的抗原性和特异性,且表达量约占总菌体蛋白的４５％。重组蛋白经金属鏊合纯化,纯度达９９％。     

小鼠canstatin及其N端片段在大肠杆菌BL21 中的表达

以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin及其N端片段基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatin及其N端片段基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,分别构建表达质粒pET/Can和pET/Can-N, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达。结果表明: 小鼠canstatin的cDNA长度为684bp,编码227个氨基酸,与已知的人canstatin cDNA同源性为89%,氨基酸的同源性为96%。小鼠canstatin N端片段(1-95aa)与人的同源性为100%。 IPTG诱导原核表达载体pET/Can和pET/Can-N在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的35% 和 18%, 重组蛋白主要以包涵体形式存在。文中报道的小鼠canstatin 及其N端片段核苷酸序列已收入GenBank, 接受号分别为: AY375463和AY502946。Abstract:The mouse canstatin and its N-domain cDNA were amplified from total RNA of mouse liver by RT- PCR and cloned into vector pMD18-T for sequencing. Prokaryotic expression vectors pET/Can and pET/Can-N were constructed and expressed in E.coli BL21(DE3) with induction of IPTG.. Mouse canstatin cDNA is 684bp in length encoding 227 amino acids. The sequences of both cDNA and amino acids share high homology with human canstatin, with cDNA identity at 89% and amino acids identity at 96% to human canstatin. N-domain of mouse canstatin is the same amino acid sequence as that of human canstatin. In the present study, prokaryotic expression vector pET/Can and pET/Can-N were expressed in E.coli BL21 with amount of 35% and 18% of the total bacterial proteins after being induced by IPTG for 4h. The expressed products existed mainly as inclusion bodies. This work has laid down the basis for further study of its angiogenic activity and potential application for tumor dormancy therapy.     

家蚕细小病毒样病毒（BmPLV-Z） VD1 ORF4的原核表达

对家蚕细小病毒样病毒（BmPLV-Z）VD1 ORF4理论上编码的氨基酸序列进行Blast搜索,结果表明其与DNA聚合酶B家族同源。通过PCR扩增其DNA聚合酶同源区（1 077 bp）,将扩增的目的DNA片段与原核表达载体pET30a进行连接,通过不同浓度的IPTG对捕获pET30a-1 077 bp重组质粒的大肠埃希菌进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳,结果表明其聚合酶同源区获得了表达;Western blot分析进一步确证诱导蛋白为带有6个组氨酸的融合蛋白。将割胶获得的目的蛋白免疫昆明小鼠制备其多抗,以纯化后的抗血清对VD1 ORF4全长序列和部分序列在原核中的漏扫描表达情况进行研究,SDS-PAGE和Western blot结果表明VD1 ORF4全长序列和部分序列的原核表达产物均一,都只有一条特异的目的蛋白带,说明了VD1 ORF4序列在原核表达系统中没有漏扫描表达的蛋白。     

Genomic and cDNA cloning, characterization of Delonix regia trypsin inhibitor (DrTI) gene, and expression of DrTI in Escherichia coli

Degenerate primers were designed based on all possible sequences of the N-terminal and C-terminal regions of Delonix regia trypsin inhibitor (DrTI). Five hundred sixty-one bp of polymerase chain reaction (PCR) product was amplified using the above degenerate primers and genomic DNA and cDNA of Delonix regia as a template. The amplified PCR products were cloned and sequenced. DNA sequence analysis of cDNA and genomic clones of DrTI have the same nucleotide sequence in the coding region, and manifested a genomic clone without intervening sequences in the coding region. The amino acid sequence deduced from the DrTI genomic and cDNA clones agreed with that identified via amino acid sequencing analysis, except that two amino acid residues, Ser and Lys, existed between residues Lys141 and Ser142. DrTI open reading frame was then amplified and cloned in-frame with GST in pGEX4T-1 and overexpressed in Escherichia coli to yield a glutathione S-transferase (GST)-fusion protein with a calculated molecular mass of about 45 kDa. The recombinant DrTI (reDrTI) was derived by treating the GST-DrTI fusion protein with thrombin. Both the reDrTI and GST-DrTI fusion protein exhibited a strong identical inhibitory effect on trypsin activity.     

SA-hIL2双功能融合蛋白的研制及其生物学鉴定

目的：制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法：构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化,透析复性。CCK-8法检测SA-hIL2融合蛋白对PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性,流式细胞仪分析SA-hIL2融合蛋白对生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面锚定修饰效率。结果：SA-hIL2在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体总蛋白的20％,制备的SA-hIL2融合蛋白纯度达到95％,并具有双重活性,即hIL-2促进PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性和SA介导的高效结合至已生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面的功能（表面锚定修饰效率约95％）。结论：研制的SA-hIL2融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。     

运用重叠延伸PCR技术构建在甘丙肽全长cDNA嵌入第二内含子的重构分子

构建嵌入第二内含子的甘丙肽(Galanin,GAL)全长基因组cDNA的重构分子。通过RT-PCR扩增出cDNA编区的序列,分别从基因组中扩增出cDNA的5′和3′端部分非编码序列;使用重叠延伸PCR(overlap extention PCR,OE-PCR)方法将三个片段重叠获得全长cDNA序列;再将全长cDNA从第三外显子第15个碱基处分成两部分,分开的cDNA前半部分和后半部分以及第二内含子进行重叠延伸获得重构分子,含有第二内含子的甘丙肽(GAL)全长基因组cDNA;将重构分子连入pMDI9-Tsimple载体。电泳分析观察到清晰的重构分子片段;测序显示重构分子由所设计的序列组成,第二内含子插入的位置准确,且无移码。使用重叠延伸PCR能够成功在cDNA中插入内含子获得一段重构基因。     

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达

人脑源性神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中表达何晓龙,路长林,王成海（第二军医大学神经生物学教研室,上海２００４３３）关键词神经营养因子;基因克隆脑源性神经营养因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｉｃ…ｉ。血。ｔｏｒ,ＢＤ贾助是Ｂａｄｅ等人...     

人IL-3基因原核表达载体的构建及表达

目的:构建人IL-3基因原核表达载体pET32a-IL-3,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:通过佛波酯(TPA)和植物球血凝素(PHA)刺激人T淋巴细胞系Jurkat细胞,增加IL-3mRNA表达水平,提取mRNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA,以Jurkat细胞cDNA为模板,通过PCR方法扩增得到人IL-3基因,将其克隆入原核表达载体pET32a(+)中,将重组质粒转化入大肠杆菌宿主菌株BL21中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过改变IPTG浓度,诱导时间,诱导温度等条件最终实现蛋白的可溶性表达。表达产物用SDS-PAGE检测表达情况。结果:酶切鉴定和测序结果证明成功构建了原核表达载体pET32a-IL-3。SDS-PAGE检测结果证明实现了人IL-3基因在大肠杆菌中的可溶性表达。结论:成功构建了人IL-3基因的原核表达载体并在大肠杆菌中获得了良好的表达。     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

Sequence of pig 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase Type3 cDNA and its expression in mammalian cells

17beta-Hydroxysteroid dehydrogenase (17beta-HSD) Type3 is an NADPH-dependent membrane-bound enzyme that is specifically expressed in testis and catalyzes the conversion of androstenedione to testosterone. To date, the sequence of Type3 enzymes has been clarified in humans, mice and rats; however, the sequence of the pig enzyme remains unknown. In this study, we determined the cDNA sequence of pig testicular 17beta-HSD Type3. PCR primers for partial pig testicular 17beta-HSD Type3 were designed from rat and human enzyme consensus sequences. Full-length cDNA was obtained by 3'- and 5'-RACE based on partial PCR products. The cDNA coding region was 933 bp in length, which is the same as the human enzyme, and shared 84.7% sequence identity with the human cDNA coding region. The monomer was estimated to have a molecular weight of 34,855 and to contain 310 amino acid residues. The predicted pig amino acid sequence showed 81.9, 75.5 and 72.9% sequence identity with the human, rat and mouse sequences, respectively. To elucidate 17beta-HSD Type3 activity, the expression vector pCMV/pig17beta-HSD3 was established and transfected into human embryo kidney 293 cells. Subsequently, 17beta-HSD activity (androstenedione conversion to testosterone) was strongly detected in cell lysates.     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。