酶(DNA聚合酶Ⅰ的克林诺夫片段)促合成Polyd(G-C)_n

本实验运用遗传工程菌株Pcj155高效表达的DNA聚合酶Ⅰ成功地合成左旋Z-DNA的重要材料polyd(G-C)_n。迄今为止,尚未发现有关这方面成功的报道。该酶的产量比国外报道的大肠杆菌和小球菌DNA聚合酶Ⅰ的产量高100倍以上。同时发现60—85％硫酸铵沉淀的酶(纯化部分Ⅲ)合成多聚脱氧核     

一种简单高效的5''''-突出末端平端化方法

目的:报道一种利用Pfu DNA聚合酶延伸法补平限制片段5’-突出末端的平端化方法。方法:Pfu DNA聚合酶是用于PCR扩增的常规高保真DNA聚合酶,可在DNA模板和dNTPs存在条件下,沿5’→3’方向催化寡聚核苷酸聚合。由于终产物为平末端,可利用这一特点进行限制片段5’-突出末端补平。本文采用这一方法消除pAN7-1潮霉素抗性标记末端的XbaⅠ位点,以便载体构建中能够利用这一常见位点。pAN7-1先用XbaⅠ酶切成线性化载体,产生的5’-突出末端再用Pfu DNA聚合酶延伸法补平,通过平端化载体自连后XbaⅠ位点的消除来评价Pfu DNA聚合酶的平端化效果。结果:随机挑取3个重组子提取质粒均不能再用XbaⅠ切开,表明XbaⅠ位点成功消除。结论:Pfu DNA聚合酶具有高效率及高保真特性,因此本法简单高效而且经济适用。     

一种简单高效的5＇-突出末端平端化方法

目的：报道一种利用Pfu DNA聚合酶延伸法补平限制片段5’-突出末端的平端化方法。方法：Pfu DNA聚合酶是用于PCR扩增的常规高保真DNA聚合酶,可在DNA模板和dNTPs存在条件下,沿5’→3’方向催化寡聚核苷酸聚合。由于终产物为平末端,可利用这一特点进行限制片段5’-突出末端补平。本文采用这一方法消除pAN7-1潮霉素抗性标记末端的XbaⅠ位点,以便载体构建中能够利用这一常见位点。pAN7-1先用XbaⅠ酶切成线性化载体,产生的5’-突出末端再用Pfu DNA聚合酶延伸法补平,通过平端化载体自连后XbaⅠ位点的消除来评价Pfu DNA聚合酶的平端化效果。结果：随机挑取3个重组子提取质粒均不能再用XbaⅠ切开,表明XbaⅠ位点成功消除。结论：Pfu DNA聚合酶具有高效率及高保真特性,因此本法简单高效而且经济适用。     

DNA聚合酶I的发现与意义

DNA聚合酶I是在DNA双螺旋结构模型提出后被发现的，阿瑟·科恩伯格在研究过程中起到至关重要的作用。在其研究成果的推动下，大肠杆菌DNA聚合酶I得到进一步揭示，并催生了PCR技术的问世，同时也促进了其他DNA聚合酶的发现。     

主编导读

<正>本期主要选择具有创新性的技术方法和工具、新的研究思路和发现、新的生物合成路线相关研究论文以及具有新视角的综述进行导读。热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高的DNA聚合酶在PCR反应中具有广泛的用途。翁妍等^[1]从超嗜热古菌（Thermococcus eurythermalis）中克隆了一个B家族DNA聚合酶,命名为Teu-PolB DNA聚合酶。该DNA聚合酶的扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶。扩增产量略高于Pfu DNA聚合酶,但弱于商品化Taq DNA聚合酶,在高保真DNA片段扩增中具有一定的应用前景。     

DNA聚合酶Polι的研究进展

Y家族DNA聚合酶是一种跨损伤复制酶,即能以损伤的DNA为模板进行复制。Y家族DNA聚合酶广泛分布生物界,人类细胞中Y家族DNA聚合酶至少包括Rev1、Polκ、Polι、Polη四种,Polι在以DNA为模板进行复制时错配率很高而不同于其他跨损伤DNA聚合酶,Polι是目前发现的所有DNA聚合酶中保真性最低的DNA聚合酶。很高的错配率导致很高的突变率,最后基因的突变导致癌症的发生,因此Polι在各个国家被广泛的研究,并且对Polι的各个不同的特性进行了研究,取得了一系列成果,现对Polι的研究进展予以综述,并展望了未来的研究趋势。     

DNA聚合酶Polι的研究进展

Y家族DNA聚合酶是一种跨损伤复制酶,即能以损伤的DNA为模板进行复制。Y家族DNA聚合酶广泛分布生物界,人类细胞中Y家族DNA聚合酶至少包括Rev1、Polκ、Polι、Polη四种,Polι在以DNA为模板进行复制时错配率很高而不同于其他跨损伤DNA聚合酶,Polι是目前发现的所有DNA聚合酶中保真性最低的DNA聚合酶。很高的错配率导致很高的突变率,最后基因的突变导致癌症的发生,因此Polι在各个国家被广泛的研究,并且对Polι的各个不同的特性进行了研究,取得了一系列成果,现对Polι的研究进展予以综述,并展望了未来的研究趋势。     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

生物化学教材中E. coli DNA聚合酶Ⅲ的组成和结构变化

所有生物化学教材均把大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) DNA聚合酶Ⅲ当做DNA复制的模式分子介绍，但新的研究结果发现，最新探索的E. coli DNA聚合酶Ⅲ的结构与原来描述的结构已有很大的不同。我国目前的生物化学教材对E. coli DNA聚合酶Ⅲ的结果描述仍旧采用旧的模型，已经落后于新的研究发现，需要及时更新。为促进我国生物化学教材建设，本文介绍了新版国际生物化学教材《Lehninger Principles of Biochemistry》描述的E. coli DNA聚合酶Ⅲ结构，以供教学交流。     

用载体pUR222分析乙型肝炎病毒基因片段的DNA顺序

将含有乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的基因片段用核酸外切酶BAL-31消化,加EeoR Ⅰ接头,插入载体pUR222的多克隆接头的EcoR Ⅰ位点,转化受体菌Ecoli K12 BMH 71-18,取3个产生HBcAg水平不一的克隆株重组子作DNA顺序分析,用Sal Ⅰ从接头当中靠近Pst Ⅰ位点一端将重组DNA切开,用(α-~(?)P)dCTP和DNA聚合酶Ⅰ klenow片段,标记3＇末端,并将粘性末端补平,再用pst Ⅰ从靠近此位点(~(?)P)标记的3＇末端切掉四个核苷酸,使只保留一个标记末端,采用Maxam和Gilbert的方法化学降解,由互补链3＇端阅读DNA顺序,发现HBcAg表达水平与mRNA的起始密码前保留发卡结构的长短有很大关系。     

病毒ki-ras表达质粒的构建

用重组DNA技术构建了病毒ki-ras表达质粒,用Eco R Ⅰ和Bam H Ⅰ酶解pUC-9DNA,小牛肠碱性磷酸酶脱磷酸,病毒ki-ras编码基因来源于Hi-Hi-3质粒DNA的Sat Ⅱ和Eco R Ⅰ酶切的0.6kb片段,用连接酶和DNA聚合酶Klenow片段将两个片段连接,转化大肠杆菌JM103,免疫筛选表达质粒,从156个转化克隆中得到两株表达质粒,其中一株pKras83的p21蛋白表达量为细菌总蛋白量的10％。     

纳米金对PCR扩增效率影响的机制探讨

近年来,纳米金粒子对聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的增效作用倍受关注,但是其具体的机制仍未明确提出。研究发现在PCR反应中,纳米粒子的增效作用是存在最佳浓度的,增加DNA聚合酶或者小牛血清蛋白（BSA）可以消除纳米金粒子导致的抑制。我们认为,纳米金粒子可能起到了类似于聚合酶B亚基的作用,提高了DNA聚合酶的延伸能力;而过量纳米金对PCR的抑制作用可能与纳米金结合单链DNA产生的位阻效应有关。     

哺乳动物DNA聚合酶及其功能研究的进展

本文介绍了哺乳动物的三个主要的DNA聚合酶及其生物功能的研究进展,特别是1975年以后的研究进展。简要地比较了DNA聚合酶α、β、γ的物理化学性质和生物化学性质,并选择有说服力的材料阐明了DNA聚合酶α是负责DNA复制的主要聚合酶;DNA聚合酶β在DNA修复中发挥作用;而DNA聚合酶γ通过单链置换合成(single strand displacment synthesis)在线粒体中起复制作用,在细胞核中则可能起基因放大等作用。     

跨损伤合成的DNA聚合酶——一类新的DNA聚合酶

细胞虽然拥有多种修复途径,但有些DNA损伤仍不可避免地会逃避修复而在基因组上保留下来,细胞跨损伤DNA合成的分子机制一直是DNA修复中主要的未解决问题之一.最近通过对一类结构相关性UmuC/DinB蛋白质超家族成员的研究发现它们具有DNA聚合酶功能.这类新发现的DNA聚合酶不同于经典的复制性DNA聚合酶,它们能以易误/突变(error-prone/mutagenic)或无误(error-free)方式进行跨损伤(translesion)DNA合成,并且从细菌到人在进化上功能保守.     

DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的评估不同DNA聚合酶是否会对以16SrRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至"种"水平的测序分析。结果经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P>0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅲ.三尖杉酯碱抑制作用动力学及其衍生物作用的比较

本文报告了三尖杉酯碱抑制艾氏腹水癌细胞DNA聚合酶α的动力学。三尖杉酯碱的抑制作用与反应体系中的模板DNA量有关,过量的DNA可降低药物的抑制作用,但不能完全消除药物的抑制。并证明三尖杉酯碱与模板DNA对DNA聚合酶α是混合型抑制,当三尖杉酯碱浓度为10μM时,其K_i值为9.5μM,K_m值为13μg DNA/100μl。三尖杉酯碱抑制DNA聚合酶α的能力不受反应体系中四种脱氧核苷三磷酸底物浓度的影响,通过同时改变四种底物浓度,或固定三种底物浓度只改变其中一种底物的量,或采用限制性DNA合成系统(Limited DNA Synthesis)即在完全体系中省略去某一底物,均证明三尖杉酯碱与四种底物对DNA聚合酶α为非竞争性抑制,当三尖杉酯碱浓度为4μM时,对dCTP、dGTP和dTTP的K_i值分别为12μM、11μM和12μM。本文也比较了三尖杉酯碱衍生物——高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和表三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的抑制作用。结果表明,当药物浓度相同时,高三尖杉酯碱的作用较三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱强,而三尖杉酯碱和异三尖杉酯碱的作用相近;表三尖杉酯碱本身对DNA聚合酶α无抑制作用,也未见其在无细胞系统中对三尖杉酯碱的抑制能力有加强作用。以上药物对E.coli DNA聚合酶Ⅰ也有相似的抑制作用。     

DNA复制和表达过程中的“水”

遗传信息的传递和表达主要指DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译,属小分子单体物聚合成大分子物的过程。以文献、资料为依据,发现主要由DNA聚合酶、DNA连接酶和RNA聚合酶参与的DNA新链合成过程,由RNA聚合酶催化的RNA链延伸过程,以及由氨酰-tRNA酶、转肽酶等参与的肽链形成过程中均没有水的形成。     

抗-20诱导的三眠家蚕后丝腺RNA聚合酶和RNA的合成

蚕在4龄期开始的48小时连续取食抗-20,4眠家蚕被诱导成3眠蚕并吐丝结茧。根据对α-鹅膏蕈碱的敏感性,放线菌素D的抑制作用,DNA需要以及[~3H]-UMP掺入酸不可溶物,测定了蚕后丝腺的RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ活力。观察到随着抗-20处理后天数的增加,RNA聚合酶在热变性小牛胸腺DNA和内源DNA上转录活性迅速升高,并伴随着RNA合成的迅速增加;而对照组蚕的酶活力和RNA含量仍保持在相当稳定的低水平。     

一种喜温酶能加速DNA定序

Cetus公司的一些研究人员已注意到一些能在天然温泉水中生长的异常细菌,并从中发现有一种耐热酶可以改进其一项新的DNA扩增技术。这项技术有希望对艾滋病(AIDS)和其它一些疾病作出更好的DNA探针诊断。DNA扩增技术需要一系列重复循环。每次循环中都有一步需要高温,因高温能使需要反应的DNA聚合酶试剂失活。所以,每次循环都必须添加额外的DNA聚合酶。利用一种喜温水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热DNA聚合酶