ORP4L多克隆抗体的制备及其在蛋白质组学研究中的应用水

目的：原核表达并纯化人氧化固醇结合蛋白相关蛋白4（ORP4L）肽段,制备兔抗人ORP4L多克隆抗体,并利用其进行蛋白质组学研究。方法：应用PCR技术扩增人ORP4L382-485氨基酸（ORP4Lm）的基因序列并插入到PGEX-4T—1载体中,在大肠杆菌RosettaTM（DE3）中表达融合蛋白GST-ORP4Lm。利用所表达的融合蛋白中含有的GST标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人ORP4L多克隆抗体。用Western blotting检测抗体免疫特异性。将亲和纯化后的抗体偶联到CNBr-actived sepharosC beads上,利用免疫沉淀的方法,通过质谱仪分析鉴定可能与ORP4L存在相互作用的蛋白质。通过West—ernblotting进一步确证特异性的相互作用蛋白。结果：在大肠杆菌中表达并纯化了GST-ORP4Lm重组蛋白,用其免疫新西兰大兔．成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blotting证实该抗体可以特异识别内源性及外源性的ORP4L蛋白。质谱分析和Western blotting的结果表明所制备的多克隆抗体可以用于蛋白质组学研究。结论：利用重组的GST-ORP4Lm融合蛋白成功制备了有良好特异性的ORP4L多克隆抗体,并可将其用于ORP4L的蛋白组学研究。     

ORP4L 多克隆抗体的制备及其在蛋白质组学研究中的应用

目的:原核表达并纯化人氧化固醇结合蛋白相关蛋白4(ORP4L)肽段,制备兔抗人ORP4L多克隆抗体,并利用其进行蛋白质组学研究。方法:应用PCR技术扩增人ORP4L 382-485氨基酸(ORP4Lm)的基因序列并插入到PGEX-4T-1载体中,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)中表达融合蛋白GST-ORP4Lm。利用所表达的融合蛋白中含有的GST标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人ORP4L多克隆抗体。用Western blotting检测抗体免疫特异性。将亲和纯化后的抗体偶联到CNBr-actived sepharose beads上,利用免疫沉淀的方法,通过质谱仪分析鉴定可能与ORP4L存在相互作用的蛋白质。通过West-ern blotting进一步确证特异性的相互作用蛋白。结果:在大肠杆菌中表达并纯化了GST-ORP4Lm重组蛋白,用其免疫新西兰大兔,成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blotting证实该抗体可以特异识别内源性及外源性的ORP4L蛋白。质谱分析和Western blotting的结果表明所制备的多克隆抗体可以用于蛋白质组学研究。结论:利用重组的GST-ORP4Lm融合蛋白成功制备了有良好特异性的ORP4L多克隆抗体,并可将其用于ORP4L的蛋白组学研究。     

人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备

FBXO31位于人染色人体16q24.3,是一个乳腺癌候选抑癌基因。为了获得抗FBXO31的多克隆抗体,构建了FBXO31基因的原核表达质粒pET-28a-FBXO31。将原核表达质粒pET-28a-FBXO31转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,IPTG诱导表达融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体形式存在,常规方法纯化包涵体。将纯化的pET-28a-FBXO31融合蛋白用于免疫新西兰大白兔获得抗血清,用pET-28a-FBXO31对抗血清进行分离纯化,得到抗FBXO31多克隆抗体。用Western印迹和免疫沉淀对其进行初步鉴定。获得了兔抗人FBXO31的多克隆抗体,为进一步研究FBXO31的生物功能提供了有用的工具。     

人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

ANKRD17蛋白抗体的制备、纯化及检测

目的：制备ANKRD17（P260）蛋白的兔多克隆抗体,以与抗原相结合的方法进行抗体的纯化,并利用纯化的抗体对该蛋白进行细胞内免疫荧光检测。方法：构建表达GST—ANKRD17C端融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达;制备GST—ANKRD17C端抗原融合蛋白后免疫家兔,对获得的兔多克隆抗血清进行亲和纯化;纯化后的抗体经过Western blot鉴定,用于细胞免疫荧光染色检测。结果：获得较高效价的血清抗体,并对血清抗体进行了纯化;利用纯化的抗体对ANKRD17蛋白进行了细胞内免疫荧光检测,发现改蛋白定位于细胞质中。结论：制备得到的纯化抗体为研究ANKRD17蛋白的功能打下了必要的基础。     

SDHB蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

SDHB(succinate dehydrogenage complex,subunit B)基因可能介导呼吸链生物功能和调控细胞生长.采用PCR技术扩增出SDHB基因,并将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体中,经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体.获得了SDHB原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗SDHB多克隆抗体,为SDHB进一步的功能研究奠定了基础.     

小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白的构建及多克隆抗体制备

目的：构建小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：将小鼠睾丸组织Vad1.2转录本行RT-PCR扩增,通过DNA重组技术插入克隆载体p ET15b,进行酶切及DNA序列分析。将表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）RIL感受态细胞,10 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白,通过10%SDS-PAGE、Western blotting及质谱分析进行鉴定。随后对重组Vad1.2蛋白进行纯化和进一步鉴定。最后,制备兔抗小鼠Vad1.2多克隆抗体,并通过Vad1.2-EGFP质粒转染GC-2spd（ts）细胞对其特异性进行验证。结果：大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞中诱导表达并纯化的小鼠Vad1.2重组蛋白构建正确并经Western blotting和质谱分析得到证实。所制备的多克隆抗体可特异性识别GC-2spd（ts）细胞中过表达的Vad1.2-EGFP融合蛋白。结论：成功构建小鼠Vad1.2重组蛋白,并制备多克隆抗体,为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。     

糖基因Glt8d2重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建新糖基转移酶基因Glt8d2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗GltSd2蛋白多克隆抗体并进行鉴定。方法应用RT—PCR技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增Glt8d2目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a（＋）-Glt8d2。转化大肠埃希菌B121,异丙基-D-半乳糖苷诱导并通过SDS—PAGE凝胶电泳分析、Western印迹分析、生物质谱分析证实Gh8d2重组蛋白表达正确。大量表达后利用Ni’亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Gh8d2蛋白的多克隆抗体。以纯化的Glt8d2重组蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western印迹和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。结果扩增获得Glt8d2基因片段,成功表达了Gh8d2重组蛋白,经SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析得到证实。成功获得重组蛋白及兔抗Gh8d2多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价〉1：320000。免疫组织化学分析显示,该基因编码的糖基转移酶在肝实质细胞内呈胞质模式表达分布。结论利用大肠埃希菌B121能够成功表达Gh8d2重组蛋白,获得高特异性、高效价兔抗Glt8d2重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究Glt8d2基因的生物学功能研究奠定了基础。     

人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 ,为下阶段深入AWP1功能研究提供了重要的基础     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

大鼠热休克蛋白70的融合表达及纯化鉴定

目的：在大肠杆菌中高效表达并纯化大鼠热休克蛋白（HSP）70与麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白,以进一步研究细胞外HSfr70的生物学功能。方法：用RT-PCR方法扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序;将该重组表达载体转化大肠杆菌B121,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,建立最佳诱导表达条件;采用Amylose树脂预装柱对目的蛋白进行亲和纯化,并对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果：克隆出目的基因,构建了融合表达载体pMAL-c2X／hsp70;诱导表达后经SDS-PAGE检测表明获得了目的条带,并纯化出纯度较高的融合蛋白;免疫印迹鉴定表明其具有抗原活性。结论：在大肠杆菌中高效表达并纯化了融合蛋白MBP-HSP70,为进一步研究细胞外HSP70的生物学效应提供了有用的材料。     

自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备

目的：克隆自噬相关基因Atg5,在大肠杆菌中重组表达后制备抗Atg5多克隆抗体。方法：用RT-PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆Atg5基因,连接至pQE80L原核表达载体后转化大肠杆菌DH50α进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达蛋白;目的蛋白纯化后,以100μg／kg纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备抗Atg5多克隆抗体;提取RAW264．7细胞总蛋白,以制备的抗Atg5多抗进行Westernblot反应,检测多抗的生物学活性。结果：克隆了Atg5基因,在大肠杆菌中表达了重组Atg5,SDS-PAGE分析显示表达产物相对分子质量与预期值一致,Western blot结果证明该产物具有较高的生物学活性,纯化蛋白免疫动物后制备了抗Atg5多克隆抗体。结论：在大肠杆菌中表达了重组Atg5,制备了抗Atg5多克隆抗体,为自噬的检测和研究提供了工具。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人 N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备

目的：在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ（ATMDSI）和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I（HsGnTI）,制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法：用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μs／ks的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制各其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果：获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45．3×10^3和46．9×10^3,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论：获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

目的：在体外克隆和表达猪肠产毒性大肠杆菌（ETEC）K88ae菌毛操纵子,触结构基因,并检测重组菌毛的相关生物学活性。方法：利用长PCR技术以猪ETECK88ae株C83902基因组DNA为模板扩增编码K88菌毛操纵子触基因,克隆入表达质粒载体pBR322,构建和筛选重组质粒pBR322-fae,转化至不含任何菌毛的大肠杆菌EP株;电镜观察重组菌表面菌毛表达情况;用热抽提法提纯表达的重组菌毛;用纯化菌毛免疫小鼠制备高效价抗血清;用SDS-PAGE和Western blot检测重组菌毛的抗原性,用细胞黏附和黏附抑制试验检测其生物学活性。结果和结论：在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88ae菌毛,该重组菌与兔抗K88ae菌毛单因子阳性血清、鼠抗K88ac菌毛单克隆抗体均产生凝集反应;纯化菌毛经SDS-PAGE,结构单位菌毛呈单一的相对分子质量约26×10^3的蛋白条带;纯化菌毛免疫小鼠后可制备出高效价的鼠抗血清,玻板凝集试验和Western blot结果表明体外表达的K88ae菌毛具有与K88ae野生菌毛相同的抗原性;猪小肠上皮细胞系黏附和黏附抑制实验结果表明重组EP菌和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力,而且提纯重组菌毛制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组菌或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。