出芽短梗霉产聚苹果酸发酵条件的优化

【背景】出芽短梗霉可发酵葡萄糖生成聚苹果酸,但存在转化率和转化效率低等瓶颈,阻碍其实现商业化生产。【目的】通过优化发酵培养条件,提高出芽短梗霉的聚苹果酸产量、糖酸转化率和生产强度。【方法】采用单因素试验优化适宜出芽短梗霉BK-10菌株产生聚苹果酸的培养条件,通过Plackett-Burman法对培养基组分筛选显著性影响因素,并对其培养基中无机盐进行正交试验优化,最后进行5 L发酵罐验证。【结果】最优培养基配方和培养条件:100 g/L葡萄糖,1.5 g/L尿素,0.20 g/L KH_2PO_4,0.20 g/L ZnSO_4,0.05 g/L MgSO_4,0.75 g/L KCl,30 g/L CaCO_3,0.01%吐温-80,发酵温度26°C,250 mL摇瓶装液量50 mL。【结论】通过优化,聚苹果酸的糖酸转化率达到0.71 g/g,生产强度达到0.89 g/(L·h),较优化前分别提高了18.33%和71.15%,为发酵葡萄糖合成聚苹果酸进而生产L-苹果酸工艺的工业化生产奠定经济性基础。     

枯草芽孢杆菌基因修饰生产核黄素

【目的】研究枯草芽孢杆菌核黄素合成途径、木糖代谢相关基因修饰对核黄素合成的影响。【方法】单独过表达或共同过表达核黄素操纵子中的基因、过表达木糖代谢相关基因构建相应的重组菌株。通过测定和比较重组菌株摇瓶发酵的核黄素产量和生物量,表征各个基因修饰的效应。采用摇瓶和5 L罐发酵,考察木糖作为主要碳源以及木糖与蔗糖共代谢对核黄素发酵的影响。【结果】ribA基因单独过表达,使核黄素产量提高99%,但生物量降低30%,出现细胞自溶现象。ribA-ribH基因共表达,使核黄素产量提高280%,并且无细胞自溶和生物量下降现象。1.5%蔗糖与6.5%木糖作为碳源,5 L发酵罐发酵70 h,核黄素产量达到3.6 g/L,与8%蔗糖为碳源的发酵相比,核黄素产量提高80%。木糖代谢相关基因过表达,均明显降低核黄素产量。【结论】与ribA基因单独过表达相比,ribA-ribH基因共表达可有效避免细胞自溶现象,并能进一步提高核黄素产量。蔗糖与木糖共代谢,能够改善前体物供给,有利于提高核黄素产量。     

米根霉在氮源限制下的木糖代谢和关键酶特性北大核心CSCD

【目的】解析氮源浓度对米根霉木糖代谢途径及产物的影响,提高木糖利用率。【方法】以木糖为碳源,考察不同氮源浓度下米根霉的生物量、有机酸积累量、木糖代谢关键酶(木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)活力以及胞内还原力(NADH/NAD+、NADPH/NADP+)的差异。【结果】富氮条件下(2.4 g/L尿素),木糖代谢速率达2.03 g/(L·h),木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力较高,生物量达18.01g/L,几乎不积累有机酸;限氮条件下(0.15 g/L尿素),木糖还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及胞内还原力水平降低,生物量仅4.02 g/L,富马酸积累量为6.55 g/L,残余木糖量较高;氮源浓度为0.6 g/L时,木糖还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力以及NADPH/NADP+处于前二者之间,此时生物量9.11 g/L,有机酸积累量较大,其中富马酸为12.28 g/L。【结论】充足的氮源可使米根霉通过木糖代谢关键酶与胞内还原力的协同效应强化木糖代谢活力,通过优化氮源浓度后,米根霉可积累更多有机酸。     

罗氏真养菌W50的D-木糖代谢途径工程改造

【目的】拓宽高产聚-β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)罗氏真养菌(Ralstonia eutropha)W50的碳源使用范围,使其获得D-木糖代谢能力。【方法】运用PCR技术扩增大肠杆菌(Escherichia coli)K-12W3110来源的D-木糖转运蛋白基因xylE,利用同源重组技术将xylE基因整合到R.eutropha W50的染色体上构建菌株W50-E。运用PCR技术扩增E.coli K-12 W3110来源的D-木糖代谢基因xylAB和R.eutropha H16来源的PHA合酶基因phaC1的启动子片段P pha C1,同表达载体连接后构建重组质粒p1-AB。将重组质粒分别转入菌株R.eutropha W50和W50-E中构建工程菌株W50-AB和W50-EAB。通过摇瓶发酵研究W50-AB和W50-EAB的D-木糖代谢特性。【结果】酶活分析结果表明,xylA和xylB基因在菌株R.eutropha W50中得到表达。摇瓶发酵结果表明,W50-AB在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中的最大比生长速率为0.025 h-1,在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中没有生长;W50-EAB在含0.01 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中表现出一定生长,在含0.1 mol/L D-木糖的基础发酵培养基中最大比生长速率为0.035 h-1。PHB含量分析结果表明,摇瓶发酵终点时,W50-AB和W50-EAB菌株内的PHB含量分别为细胞干重的15.07±1.01%和15.07±1.64%,其相应的D-木糖-PHB转化率分别为0.0920 g·g-1和0.0838 g·g-1,低于两重组菌株利用葡萄糖发酵的糖-PHB转化率(0.22 g·g-1)。另外,重组菌株W50-AB和W50-EAB在含葡萄糖(0.01 mol/L)和D-木糖(0.09 mol/L)的混合糖培养基中的发酵结果表明,两重组菌株均表现出更高的生长速率和D-木糖消耗速率以及胞内PHB积累量。【结论】来源于E.coli K-12W3110菌株的xylAB基因的表达使R.eutropha W50获得了一定的D-木糖代谢能力,通过D-木糖转运蛋白基因xylE的表达能提高菌株的D-木糖代谢能力,同时重组菌株利用D-木糖能积累一定量PHB。     

解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌物质培养基及发酵条件优化

【目的】优化解淀粉芽胞杆菌PC2产抑菌活性物质发酵培养基及发酵条件。【方法】以马铃薯葡萄糖液体培养基为基础,依据发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈的单因素试验结果,采用Box-Behnken响应面法优化发酵培养基,二次通用旋转组合设计,频率分析法优化发酵条件。【结果】影响发酵液抑菌活性的培养基主要组分为马铃薯、蔗糖和L-谷氨酸钠,最优发酵培养基配方为:马铃薯188.0 g/L,蔗糖22.0 g/L,L-谷氨酸钠1.80 g/L,培养基成本为0.81元/L;最佳发酵条件为:接种量6%、发酵温度30°C、装液量40 mL/250 mL、摇床转速185 r/min、发酵时间24 h、初始pH 7.0。优化后发酵液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为30.82 mm,较优化前的18.22 mm增加了12.60 mm。【结论】优化后的培养基和发酵条件提高了解淀粉芽胞杆菌PC2发酵液的抑菌活性,为该菌株的工业化生产应用提供了依据。     

混合糖发酵重组酿酒酵母的菌株构建和菊芋秸秆同步糖化发酵研究

【目的】构建可用于纤维素乙醇高效生产的混合糖发酵重组酿酒酵母菌株,并利用菊芋秸秆为原料进行乙醇发酵。【方法】筛选在木糖中生长较好的酿酒酵母YB-2625作为宿主菌,构建木糖共代谢菌株YB-2625 CCX。进一步通过r DNA位点多拷贝整合的方式,以YB-2625 CCX为出发菌株构建木糖脱氢酶过表达菌株,并筛选得到优势菌株YB-73。采用同步糖化发酵策略研究YB-73的菊芋秸秆发酵性能。【结果】YB-73菌株以90 g/L葡萄糖和30 g/L木糖为碳源进行混合糖发酵,乙醇产量比出发菌株YB-2625 CCX提高了13.9%,副产物木糖醇产率由0.89 g/g降低至0.31 g/g,下降了64.6%。利用重组菌YB-73对菊芋秸秆进行同步糖化发酵,48 h最高乙醇浓度达到6.10%(体积比)。【结论】通过转入木糖代谢途径以及r DNA位点多拷贝整合过表达木糖脱氢酶基因可有效提高菌株木糖发酵性能,并用于菊芋秸秆的纤维素乙醇生产。这是首次报道利用重组酿酒酵母进行菊芋秸秆原料的纤维素乙醇发酵。     

产L-苹果酸重组大肠杆菌的构建

基于产琥珀酸重组大肠杆菌E.coli B0013-1050的琥珀酸合成途径,利用Red同源重组技术结合Xer/dif重组系统敲除富马酸酶基因fumB、fumC,苹果酸酶基因maeB,构建L-苹果酸合成途径,最终得到重组大肠杆菌E.coli2030,该菌株在15 L发酵罐中,产L-苹果酸12.5 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率为52.1%,同时对发酵产物中主要杂酸丙酮酸和琥珀酸的生产原因进行了初步的探讨与分析。为进一步提高L-苹果酸的转化率,整合表达来源于黄曲霉的苹果酸脱氢酶基因,构建重组菌E.coli 2040,在15 L发酵罐中产L-苹果酸14 g/L,葡萄糖-苹果酸转化率提高到60.3%。     

重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸培养基的优化

【目的】提高重组谷氨酸棒杆菌发酵L-苯丙氨酸(L-phenylalanine,L-Phe)的产量。【方法】使用正交试验设计以及响应面优化法分别对种子培养基及发酵培养基进行优化,确定了重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe的最佳种子培养基及最佳发酵培养基。【结果】重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe最佳种子培养基(g/L):葡萄糖25.0,玉米浆25.0,硫酸铵15.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾2.0,尿素2.0,p H 6.8-7.0;最佳发酵培养基(g/L):葡萄糖110.0,玉米浆7.0,硫酸铵25.0,硫酸镁1.0,磷酸二氢钾1.0,柠檬酸钠2.0,谷氨酸1.0,碳酸钙25.0,p H 6.8-7.0;在最佳培养基条件下L-Phe产量最高达到9.14 g/L,较优化前的7.46 g/L提高了22.5%。【结论】通过正交试验和响应面分析对重组谷氨酸棒杆菌发酵L-Phe培养基进行优化,明显提高了L-Phe的产量,并确定了葡萄糖、玉米浆和硫酸铵为发酵培养基中影响L-Phe产量的3个关键因子。研究结果为L-Phe的发酵放大提供了依据。     

代谢改造克雷伯氏菌合成D-1,2,4-丁三醇

【背景】D-1,2,4-丁三醇(D-1,2,4-butanetriol,BT)是一种重要的四碳多元醇,应用范围广,以木糖为底物的四步生化反应是目前最高效的BT生物合成路线。但大肠杆菌宿主存在严重的碳代谢抑制,限制了工程菌在木糖葡萄糖混合糖下的生长和BT合成。然而克雷伯氏菌具有生长速度更快、葡萄糖木糖混合糖利用效果好等优点。【目的】在碳代谢抑制效应较弱的克雷伯氏菌中构建以木糖为底物的BT合成途径,以提高混合糖下BT合成能力。【方法】将来源于Clostridium crescenti的木糖脱氢酶基因xdh和来源于Lactococcus lactis的2-酮异戊酸脱羧酶基因kivD及来源于Escherichia coli W3110的木糖酸脱水酶基因yjhG克隆至KlebsiellapneumoniaeZG25,得到重组菌K.pneumoniae ZG25-BT,对重组菌进行培养条件和培养基优化,进一步敲除xylA以提高BT产量。【结果】在37°C、200 r/min、接种量1%、诱导时间2 h、添加10.0 g/L CaCO3控制pH条件下,敲除xylA的重组菌在1.5倍LB培养基中以30.0 g/L木糖和10.0 g/L葡萄糖为底物,BT的产量达到4.52 g/L,摩尔转化率为0.21mol/mol,收率为15%,较优化前分别提高150%、62%和67%。【结论】实现了BT在K.pneumoniaeZG25中的发酵生产,同时通过培养条件和培养基的优化及xylA的敲除提高了BT合成能力,为进一步实验奠定了基础。     

异源表达木糖异构酶基因对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇的影响

【目的】提高克雷伯氏菌胞内还原力以强化1,3-丙二醇合成。【方法】将来源于大肠杆菌的木糖异构酶基因在克雷伯氏菌中异源表达,构建重组菌。研究重组菌添加不同浓度木糖为辅底物与甘油共发酵过程中代谢产物和NADH的变化规律。【结果】与对照菌相比,重组菌细胞内还原力NADH提高了0.1?0.3倍,1,3-丙二醇产量达到23.31 g/L,提高20%,1,3-丙二醇转化率从0.60 mol/mol提高到0.73 mol/mol。【结论】木糖异构酶基因的表达强化了木糖代谢途径,经磷酸戊糖途径积累大量还原力,促进了1,3-丙二醇的生成。     

温特曲霉转富马酸为L-苹果酸的初步研究*

从大量霉菌中选育到一株具有较高富马酸酶活性的温特曲霉(Aspergillus wentii) A5-61。在摇瓶培养条件下,32℃ 96小时,产L-苹果酸达10.49g/100ml,对富马酸的转化率达90.80%。利用菌体细胞,进行酶转化试验,结果表明：1.6g湿菌体接入25ml含富马酸10.0%（用NaOH中和至pH7.0）的转化液中,35℃16～24小时,连续转化三次,分别产生L—苹果酸9.61g/100ml、9.73g/100ml、6.93g/100ml。对菌体整体细胞酶学性质的研究表明,其最适反应温度35℃,最适反应pH7.0,Cu2＋对该酶有明显的抑制作用,该酶的Km＝0.154mol/L,Vmax＝0.0571mol/L·h。     

戴尔根霉发酵麸皮酶解液制备富马酸的研究

拟通过根霉菌发酵小麦麸皮纤维质实现其高效生物转化制备富马酸的目标。在单因素试验研究基础上,对发酵工艺进行响应曲面法优化,并开展代谢机理初步探索。通过单因素试验确定了酵母浸粉、硫酸镁及硫酸锰质量浓度为主要影响因素,响应曲面研究结果显示:当发酵水解液总糖浓度80.0g/L、硫酸铵2.00g/L、酵母浸粉0.29g/L、硫酸镁0.26g/L、硫酸锰0.07g/L、硫酸亚铁0.05g/L时,富马酸产量最高,其值为27.423g/L。对戴尔根霉Rhizopus delemar CICC41341的木糖代谢途径的初步分析结果表明木酮糖激酶为该菌株木糖代谢的关键限速酶。论文研究结果可为纤维质糖液工业发酵制备平台有机酸提供一定支持。     

海洋来源链霉菌MY0504产纤溶酶的发酵条件优化

【目的】以发酵液纤溶酶活力为指标,优化海洋来源的链霉菌菌株MY0504的发酵条件。【方法】在菌株生长曲线及单因素试验基础上,采用Plackett-Burman设计筛选影响纤溶酶活性的主要因素,进一步用最陡爬坡试验及Box-Behnken中心组合设计法优化发酵条件。【结果】纤溶酶活性最高的发酵条件为:葡萄糖21.68 g/L,酵母粉25.31 g/L,NaCl5.0 g/L,K_2HPO_4·3H_2O3.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.02 g/L,装液量50 mL(250 mL摇瓶),接种量10%(体积比),初始pH 7.5,温度24°C,转速200 r/min,培养时间4.5 d。发酵液纤溶酶活性可达2 190.6 U/mL。【结论】确定了MY0504菌株产纤溶酶的最优发酵条件,为该酶的进一步分离纯化及性质研究奠定基础。     

Kojic acid production byAspergillus flavus using gelatinized and hydrolyzed sago starch as carbon sources

Direct conversion of gelatinized sago starch into kojic acid byAspergillus flavus strain having amylolytic enzymes was carried out at two different scales of submerged batch fermentation in a 250-mL shake flask and in a 50-L stirred-tank fermentor. For comparison, fermentations were also carried out using glucose and glucose hydrolyzate from enzymic hydrolysis of sago starch as carbon sources. During kojic acid fermentation of starch, starch was first hydrolyzed to glucose by the action of α-amylase and glucoamylase during active growth phase. The glucose remaining during the production phase (non-growing phase) was then converted to kojic acid. Kojic acid production (23.5g/L) using 100 g/L sago starch in a shake flask was comparable to fermentation of glucose (31.5 g/L) and glucose hydrolyzate (27.9 g/L) but in the 50-L fermentor was greatly reduced due to non-optimal aeration conditions. Kojic acid production using glucose was higher in the 50-L fermentor than in the shake flask.     

Improvement of kojic acid production in Aspergillus oryzae B008 mutant strain and its uses in fermentation of concentrated corn stalk hydrolysate

A strain designated M866, producing kojic acid with a high yield, was obtained by combining induced mutation using ion beam implantation and ethyl methane sulfonate treatment of a wild type strain of Aspergillus oryzae B008. The amount of kojic acid produced by the strain M866 in a shaking flask was 40.2 g/L from 100 g/L of glucose, which was 1.7 times higher than that produced by wild strain (23.58 g/L). When the mixture of glucose and xylose was used as carbon source, the resulting kojic acid production was raised with the increasing of glucose ratios in the mixture. With concentrations of glucose at 75 g/L and xylose at 25 g/L mixed in the medium, the production of kojic acid reached 90.8 %, which was slightly lower than with glucose as the sole source of carbon. In addition, the kojic acid fermentation of the concentrated hydrolysate from corn stalk was also investigated in this study, the maximum concentration of kojic acid accumulated at the end of the fermentation was 33.1 g/L and this represents the yield based on reducing sugar consumed and the overall productivity of 0.36 g/g and 0.17 g/L/h, respectively.     

休哈塔假丝酵母HDYXHT-01利用木糖生产乙醇的发酵工艺优化

采用Plackett-Burman (PB) 方法和中心组合设计 (Ccentral composit design,CCD) 对休哈塔假丝酵母Candida shehataeHDYXHT-01利用木糖发酵生产乙醇的工艺进行优化。PB试验设计与分析结果表明：硫酸铵、磷酸二氢钾、酵母粉和接种量是影响木糖乙醇发酵的4个关键因素,以乙醇产量为响应目标,采用CCD和响应面分析法 (Response surface methodology,RSM),确定了木糖乙醇发酵的最佳工艺为：硫酸铵1.73 g/L、磷酸二氢钾3.56 g/L、酵母粉2.62 g/L和接种量5.66％,其他发酵条件为：木糖80 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,pH 5.0,培养温度30 ℃,装液量100 mL/250 mL,摇床转速140 r/min,发酵时间48 h,在该条件下发酵液中乙醇产量可以达到26.18 g/L,比未优化前提高了1.15倍。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

直接利用糖质原料生产L-苹果酸菌种的选育

从土壤中筛选到一株产L－苹果酸的黄曲霉菌,经紫外线、亚硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）和^60Co辐射等诱变处理,并经多次分离得到一株性能稳定的高产L－苹果酸突变株黄曲霉HA5800,35℃,200r/min摇瓶发酵120h,产L－苹果酸72g/L、糖酸转化率为74．22％,经山东省卫生防疫站检定,该菌株不产黄曲霉素素B1。