共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响

[目的]通过共表达伴侣蛋白Erolp和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达.[方法]利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异.[结果]在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7U/mL,最大比生长速率达到0.02 h-1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW·h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW·h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20h.[结论]毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础.     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

超嗜热酯酶EST2在不同宿主中的异源高效表达研究

来源于超嗜热古菌Alicyclobacillus acidocaldarius的酯酶EST2是目前报道的活性最高的超嗜热酯酶,具有极大的工业应用价值。为促进EST2的生产应用,将其分别在大肠杆菌及毕赤酵母中进行异源表达,并就不同宿主对表达情况和重组酶酶学性质的影响进行了分析。在大肠杆菌和毕赤酵母中重组表达的EST2酶学性质基本一致:最适温度分别为75℃和77.5℃,最适pH均为8.0,比活力分别为4656.6 U/mg和4078.3 U/mg,70℃水浴保温4.5 h,残余活力均在70%以上。在摇瓶发酵的基础上,于5 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌及毕赤酵母的高密度发酵。毕赤酵母高密度发酵120 h菌体干重达68 g/L,最大表达酶活力为959.6 U/ml。大肠杆菌高密度发酵25 h菌体干重达60.8 g/L,最大酶活力14825.6 U/ml,表达量是毕赤酵母的15.4倍,单位时间产量是酵母的74.2倍。结果表明大肠杆菌发酵周期短、表达量高,更适合进行嗜热酯酶EST2的高效生产,这为促进嗜热酯酶在工业生物技术产业的应用奠定了基础。     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达

【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。     

豆血红蛋白在毕赤酵母中的表达条件优化

【背景】豆血红蛋白可赋予素肉制品类似牛肉的红褐色质地,已被美国食品药物监督管理局批准作为人造素肉的着色剂,近年来受到广泛关注。【目的】优化毕赤酵母产豆血红蛋白的培养条件,提高毕赤酵母产豆血红蛋白的产量。【方法】首先通过单因素试验研究蛋白胨种类、大豆蛋白胨浓度、铁盐种类及血红素浓度在诱导阶段对毕赤酵母产豆血红蛋白的影响;然后通过Plackett-Burman试验设计筛选出对豆血红蛋白产量影响最大的3个因素,再通过最陡爬坡法确定3个因素的变化范围,对3个因素进行响应面分析;最后根据响应面结果进行摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵。【结果】单因素试验发现：用4%大豆蛋白胨作为主要氮源、甲醇诱导浓度为1.5%、血红素浓度为5μmol/L时发酵效果较好,经过响应面优化后得到蛋白胨浓度为51.48 g/L、pH 5.66、培养基装液量35.84mL/250mL是最优发酵条件。在此优化条件下,LegH摇瓶发酵产量为0.191 mg/mL,与预测值(0.183 mg/mL)比较接近。采用5 L发酵罐进行高密度发酵,LegH产量最高达到0.384 mg/mL。【结论】优化了毕赤酵母表达豆血红蛋白的发酵条件,获得...     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展

近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平,高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计,以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵,并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。     

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

采用混合策略提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达水平

为了提高葡萄糖氧化酶 (GOD) 在毕赤酵母中的表达水平,提出了甲醇/山梨醇混合碳源诱导和共表达分子伴侣二硫键异构酶 (PDI) 和透明颤菌血红蛋白 (VHb) 两种策略。利用对照菌株X33/pPIC9k–GOD 在5 L发酵罐放大培养时,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导,GOD最终酶活为456 U/mL,比只采用甲醇作为单一碳源诱导时GOD最终酶活提高了20%。利用整合伴侣蛋白菌株X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb在5 L发酵罐进行高密度发酵,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导,GOD最终酶活达到716 U/mL,蛋白浓度为7.4 g/L。研究结果对提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

Overexpression of Candida rugosa lipase Lip1 via combined strategies in Pichia pastoris

In this study, combined strategies were employed to heterologously overexpress Candida rugosa lipase Lip1 (CRL1) in a Pichia pastoris system. The LIP1 gene was systematically codon-optimized and synthesized in vitro. The Lip1 activity of a recombinant strain harboring three copies of the codon-optimized LIP1 gene reached 1200 U/mL in a shake flask culture. Higher lipase activity, 1450 U/mL, was obtained using a five copy number construct. Co-expressing one copy of the ERO1p and BiP chaperones with Lip1p, the CRL1 lipase yield further reached 1758 U/mL, which was significantly higher than that achieved by expressing Lip1p alone or only co-expressing one molecular chaperone. When cultivated in a 3 L fermenter under optimal conditions, the recombinant strain GS115/87-ZA-ERO1p-BiP #7, expressing the molecular chaperones Ero1p and BiP, produced 13,490 U/mL of lipase activity at 130 h, which was greater than the 11,400 U/mL of activity for the recombinant strain GS115/pAO815-α-mCRL1 #87, which did not express a molecular chaperone. This study indicates that a strategy of combining codon optimization with co-expression of molecular chaperones has great potential for the industrial-scale production of pure CRL1.     

Constitutive expression of alkaline β-mannanase in recombinant Pichia pastoris

Alkaline β-mannanase has important applications for specific industrial processes like pulp bleaching and the detergent industry. The low yield of alkaline β-mannanase produced from native microbes such as alkaliphilic Bacillus limits its applications. Pichia pastoris is the most efficient heterologous system to produce alkaline mannanase. However, the previous use of the AOX system required large amount of methanol and sophisticated operation strategy, which are undesirable in large scale production. In this study, we established a safe and simple constitutive expression process for mannanase production in P. pastoris. The mannanase gene was successfully expressed under the control of GAP promoter. Sequential optimization of the constructed strains was also performed including the copy number optimization and co-expression of chaperone genes. A two-stage feeding strategy was then applied for the finally optimized strain. After 96 h fermentation, a production level of 2980 U/mL was finally reached, illustrating the potential of the GAP constitutive expression system for industrial scale preparation of alkaline β-mannanase.     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响

发酵条件是影响毕赤酵母 (P .pastoris)表达外源重组糖蛋白时糖基化的重要因素。通过菌体浓度、起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、装液量等摇瓶发酵实验 ,研究不同发酵条件对毕赤酵母表达分泌型重组人干扰素ω(rhIFNω)过程中糖基化的影响 ;同时 ,在连续培养过程中考察pH值变化对rhIFNω糖基化的影响和分批发酵过程中rhIFNω糖基化的变化。结果表明 ,控制菌体密度 250g L(WCW)、起始pH值 6 0、装液量小于 30mL、甲醇诱导浓度 15g L、甲醇诱导 3次 (每 24h诱导一次 )等发酵条件 ,有利于摇瓶发酵过程中rhIFNω的糖基化 ;控制pH值 70～75可促进rhIFNω的糖基化 ;分批发酵过程中 ,糖基化与非糖基化rhIFNω的含量有同比变化趋势 ,但糖基化rhIFNω所占比例明显低于摇瓶发酵实验的结果 ,其原因有待进一步研究。     

Novel Strategy of Using Methyl Esters as Slow Release Methanol Source during Lipase Expression by mut+ Pichia pastoris X33

One of the major issues with heterologous production of proteins in Pichia pastoris X33 under AOX1 promoter is repeated methanol induction. To obviate repeated methanol induction, methyl esters were used as a slow release source of methanol in lipase expressing mut⁺ recombinant. Experimental design was based on the strategy that in presence of lipase, methyl esters can be hydrolysed to release their products as methanol and fatty acid. Hence, upon break down of methyl esters by lipase, first methanol will be used as a carbon source and inducer. Then P. pastoris can switch over to fatty acid as a carbon source for multiplication and biomass maintenance till further induction by methyl esters. We validated this strategy using recombinant P. pastoris expressing Lip A, Lip C from Trichosporon asahii and Lip11 from Yarrowia lipolytica. We found that the optimum lipase yield under repeated methanol induction after 120 h was 32866 U/L, 28271 U/L and 21978 U/L for Lip C, Lip A and Lip 11 respectively. In addition, we found that a single dose of methyl ester supported higher production than repeated methanol induction. Among various methyl esters tested, methyl oleate (0.5%) caused 1.2 fold higher yield for LipA and LipC and 1.4 fold for Lip11 after 120 h of induction. Sequential utilization of methanol and oleic acid by P. pastoris was observed and was supported by differential peroxisome proliferation studies by transmission electron microscopy. Our study identifies a novel strategy of using methyl esters as slow release methanol source during lipase expression.