水稻rab5B基因在大肠杆菌中的表达、纯化和GTP结合分析

Rab5B类蛋白因为其编码产物的N端具有特殊结构而被认为是一类特殊的蛋白质.水稻rab5B基因Osrab5B是这类蛋白质基因在单子叶植物中的首例发现.将Osrab5B基因的编码序列按正确读码框重组到具有谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）融合标签的pGEX-4T1表达载体中,转化大肠杆菌,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株,经GSTrap^TM柱纯化,获得了纯化的目标融合蛋白.GTP结合试验表明,在原核细胞中表达出的GST-OsRab5B融合蛋白具有体外结合GTP的能力.     

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-hsd）基因,将扩增产物用NdeⅠ/BamHⅠ消化,切下目的基因片段克隆到质粒pET-15b中构建重组pET-15b.将重组pET-15b转化入E.coli DH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b.将重组pET-15b转化入宿主菌E.coli BL21(DE3) pLysS中,用硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.提取细菌总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析并测定酶活性.粗提物中酶活性高达2.45×10⁵ U/L.利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带,回收率达68%.活性和纯度均较高的目的蛋白3α-HSD的获得,为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础.     

不同水分条件下杨树-玉米复合系统凋落物分解特性

为探讨水分变化对农林复合生态系统凋落物分解特性的影响,以河西走廊杨树（Populus）-玉米（Zea mays）凋落物为研究对象,设置正常水分（9200 m³/hm²,对照）,轻度干旱胁迫（减少15%,7800 m³/hm²）,中度干旱胁迫（减少30%,6400 m³/hm²）3种不同水分处理条件,采用分解袋法研究了不同水分条件下杨树叶和玉米秸秆的质量残留率、分解速率和养分含量变化特征。结果表明：（1）随着干旱胁迫的加剧,两种凋落物的质量残留率均增加,而分解速率降低。经过164 d的分解后,杨树叶和玉米秸秆的质量残留率分别为70.43%-77.49%、63.55%-68.29%。分析表明：水分和时间对各类型凋落物的质量残留率均有极显著的影响（P<0.001）,但二者的交互作用不显著（P>0.05）;干旱胁迫显著降低了玉米秸秆的分解速率,但杨树叶的分解速率却只是在中度干旱胁迫下显著降低（P<0.05）。对于不同类型凋落物而言,分解速率表现为玉米秸秆>杨树叶。（2）两种类型凋落物的氮（N）残留率在分解过程中表现为降低的趋势,但随着干旱程度的加大,N的残留率增加,表明水分抑制了N的释放过程。分解164d后,同一类型凋落物不同水分条件下的N残留率均存在显著差异。对于同一水分条件下不同凋落物而言,玉米秸秆的N残留率最低,而杨树叶最高。总的来说,水分降低对干旱区农林复合系统内凋落物的分解和氮元素含量具有显著的抑制作用。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a的制备及其在tPA突变体纯化中的应用

将基因工程菌株E.coliBL21(DE3) pET22b-mETIa高密度发酵,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa)蛋白在E.coli中得到较高水平表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上.经菌体破碎、包涵体变性、复性,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白.测得rETIa对t-PA突变体(NTA)的抑制平衡常数K_i为8.72×10^－8 mol/L.据此利用纯化的rETIa蛋白制备rETIa-Sepharose 4B亲和层析柱.直接一步纯化NTA复性液,纯化的NTA纯度达90 %以上,收率为96.2 %,纯化倍数为13.2,比活为(565.7±71.3) U/μg.     

凋落物添加和模拟氮磷沉降对红松凋落物木质素降解和碳释放的影响

通过对阔叶红松林和红松人工林2种林型凋落物处理（分别为不添加凋落物（原样组）、添加凋落物（双倍组）和去除凋落物（去除组）等3个处理）与模拟氮磷沉降（分别为对照CK （0 g N m^-2 a^-1、0 g P m^-2 a^-1）、低浓度氮磷（5 g N m^-2 a^-1、5 g P m^-2 a^-1）、中浓度氮磷（15 g N m^-2 a^-1、10g P m^-2 a^-1）和高浓度氮磷（30 g N m^-2 a^-1、20 g P m^-2 a^-1）等4个强度）原位培养试验,研究凋落物质量的增加与氮磷沉降及两种处理的耦合作用对碳（C）和木质素分解释放的影响。结果表明：凋落物添加在试验前期（6月）抑制人工林L层的C释放,促进H层的C释放;试验后期（10月）促进人工林L层C释放,而抑制H层的C释放。凋落物添加在前期（6月）是促进天然林L层C释放的,但在后期（10月）产生抑制作用。与L层相反,凋落物添加持续促进天然林H层的C释放。低、中浓度氮磷沉降显著促进了红松人工林和阔叶红松林L、H层C释放和木质素降解,但高浓度的氮磷添加会抑制C释放和木质素的降解,两种处理之间无交互作用。     

黔西南北盘江镇喀斯特高原峡谷区植被演替阶段碳氮稳定同位素特征

为了探究森林不同演替阶段碳氮(C、N)、稳定碳氮同位素值(δ¹³C、δ¹⁵N)随演替发生的变化特征与内在联系,该文以喀斯特高原峡谷区草灌、灌木、乔灌和乔木4个演替阶段的森林植物群落为研究对象,测定了叶片-凋落物-土壤的C、N及稳定同位素值,并分析其在不同层次间的互作效应。结果表明:(1)喀斯特地区森林叶片-凋落物-土壤δ¹³C值分别为-31.31‰～-28.23‰、-29.96‰～-20.07‰、-26.83‰～-21.14‰,相应的δ¹⁵N值依次为-3.41‰～1.54‰、-2.61‰～0.99‰、5.36‰～8.63‰,总体上土壤表现出富集效应。(2)伴随着演替发生,叶片δ¹³C值与土壤δ¹⁵N值均为先减小后增大,土壤、凋落物δ¹³C值呈降低趋势,叶片和凋落物δ¹⁵N值均无明显变化规律。(3)乔灌阶段叶片-土壤δ¹⁵N值最低,表明该阶段生态系统N饱和程度较小,N含量相对亏缺。(4)叶片-土壤C、N及稳定同位素之间相关性较强,表明两者间养分循环紧密相关,具有显著抑制或促进效应。综上认为,该区生态系统修复时,应选择水分利用效率高的川钓樟(Lindera pulcherima)、圆叶乌桕(Triadica rotundifolia)、翅荚香槐(Cladrastis platycarpa)等树种,提高生态系统对资源利用和养分吸收的自调控能力。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶（ANI01589.1）,并对其进行了功能研究。[方法]首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法（HPLC）测定了该酶的催化产物。[结果]3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6 mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶（SDR）的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD⁺为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其K_m值为0.071 mmol/L,k_cat值为2.4±0.06/s^-1,5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42℃,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg²⁺和Mn²⁺可增强其酶活性。[结论]这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。     

人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

提取人心肌组织总RNA,RT-PCR扩增出人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）和肌钙蛋白C（TnC）基因,利用人工合成的可编码19个中性氨基酸残基为主的DNA序列（Linker）,将cTnI和TnC基因连接,插入到质粒pET15b中,将鉴定正确的重组pET15b质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,用异丙基-β-D–硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达.结果在大肠杆菌中成功实现了全长cTnI-C融合蛋白（cTnI-linker-TnC）的稳定可溶性高表达,在摇瓶中表达量可达21 mg/L.利用目的蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）,经一步Ni²⁺-Sepharose柱亲和层析纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯蛋白质.经初步研究,cTnI-C具有较好的免疫原性和稳定性,有望成为cTnI测定系统可溯源的候选参考物质,推进cTnI检测的标准化进程.     

凋落物多样性及组成对凋落物分解及土壤微生物群落的影响——二氧化碳倍增条件下

受全球变化的影响生物多样性的丧失日益严重,及时了解凋落物物种多样性及其组成如何直接或者通过调节微生物群落来间接影响凋落物分解已经成为生态学领域的热点问题之一。在呼伦贝尔典型草原区,羊草（Leymus chinensis）为原生群落建群种,茵陈蒿（Artemisia capillaris）、麻花头（Serratula centauroides）、二裂委陵菜（Potentilla bifurca）在退化及恢复群落中的多度均较大,本研究以此4种植物的凋落物为研究对象,在两倍于当前大气CO₂浓度（800 μmol/mol）条件下,通过嵌套实验设计来研究凋落物多样性（凋落物组成）对凋落物质量、C、N残余率和残余C/N的影响,并深入分析凋落物初始性质以及土壤革兰氏阳性菌（G⁺）、革兰氏阴性菌（G^-）、细菌（B）、真菌（F）及土壤总微生物磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid,PLFA）含量和F/B对凋落物分解的影响。结果表明：（1）凋落物多样性及组成对凋落物质量、C、N残余率以及残余C/N均具有显著影响;凋落物组成对G⁺ PLFAs含量具有显著影响;（2）冗余分析（Redundancy Analysis,RDA）结果表明凋落物组成对凋落物分解和土壤微生物群落相关指标的影响高于凋落物多样性;（3）结构方程模型（Structural Equation Model,SEM）结果表明凋落物初始木质素含量和初始C/N均对凋落物分解具有显著影响,其中凋落物初始木质素含量起主导作用,其还可通过对土壤真菌PLFAs含量的影响来间接影响凋落物N残余率和残余C/N。所得结果可为大气CO₂浓度升高条件下退化草原生态系统的物质循环特征的预测乃至草原生态系统功能的合理评估提供数据支持。     

贵州高原型喀斯特次生林C、N、P生态化学计量特征与储量

选取贵州高原型喀斯特次生常绿落叶阔叶混交林为对象,对其生态系统各组分碳（C）、氮（N）、磷（P）生态化学计量特征进行了研究,并全面估算了其生态系统C、N、P储量。结果表明,N、P含量在各树种和各器官（干、皮、枝、叶）之间表现出较大的变异,而C含量在各树种和各器官之间变异较小。C/N和C/P表现为叶片最高,树干（乔木）/枝干（灌木）最低,N/P在各器官间差异不显著（P > 0.05）。凋落物和木质残体的N/P显著（P < 0.01）高于植物活体。土壤C、N、P含量均随土壤深度的增加而降低,最表层（0-10 cm）土壤的C、N、P含量及N/P显著（P < 0.05）高于深层土壤;C/N和C/P在各土层间差异不显著（P > 0.05）。高原型喀斯特次生常绿落叶阔叶混交林的生态系统C、N、P储量分别为172.42 Mg/hm²、5.24 Mg/hm²和1.19 Mg/hm²。大部分森林C（54.69%）、N（84.46%）、P（97.26%）存储于土壤中。与非喀斯特森林相比,喀斯特森林植物叶片N、P含量低,土壤C含量高,生态系统C、N、P储量低。     

黄河口近海海草床浮游-底栖营养传递特征

为了探寻海草床浮游-底栖营养传递耦合特征,于2017年7月对黄河口近海海草床碳源和消费者功能群进行样品采集和碳氮稳定同位素（δ¹³C和δ¹⁵N）测定,计算了消费者功能群的营养级,利用基于贝叶斯的稳定同位素混合模型定量化消费者功能群的食源组成,计算了消费者功能群的浮游、底栖营养贡献比例。结果表明：黄河口近海海草床的碳源和消费者功能群的δ¹³C和δ¹⁵N值均呈现显著性差异（P<0.05）,浮游碳源的δ¹³C值显著低于底栖碳源,消费者功能群的营养级范围为1.49-4.20。浮游动物和腹足类分别由浮游和底栖营养传递途径提供能量来源,其余消费者功能群共同依赖于这两种营养传递路径。消费者功能群随着浮游营养贡献比例的增加,其δ¹³C值逐渐降低。反之,随着底栖营养贡献比例的增加,其δ¹³C值逐渐增加。这与浮游碳源和底栖碳源的δ¹³C值的分化现象一致。对该海草床营养传递特征的系统性定量化解析有助于了解海草床的能量传递模式,为海草床的生态保护和修复提供系统性视角。     

巢湖碳氮地球化学沉积记录揭示全新世以来的环境演化

通过对巢湖湖泊沉积物的总有机碳（TOC）、总氮（TN）、有机碳同位素（δ¹³C_org）、氮同位素（δ¹⁵N）和粒度参数的研究，重建了全新世以来湖泊初级生产力的变化，从而揭示了巢湖地区全新世环境变化历史。早全新世时期（10100-8200 cal a BP），较高的TOC和TN、在波动中逐渐升高的δ¹³C_org值以及高δ¹⁵N值、高黏土（<4 μm）含量指示了较高的湖泊初级生产力，反映气候温暖较湿；中全新世时期（8200-4200 cal a BP），TOC、TN、δ¹³C_org值和黏土（<4 μm）含量总体上较高但呈波动降低趋势，粉砂（4-64 μm）含量升高，δ¹⁵N值总体较低但变化幅度较大，指示初级生产力由较高水平开始逐渐降低，气候由温暖湿润逐渐向凉干方向发展；7300-5800 cal a BP和4300-3800 cal a BP的低δ¹⁵N和高TN值可能受到固氮蓝藻的影响，分别对应着7500-7000 cal a BP和4200-4000 cal a BP气候事件时期夏季风强度的减弱；晚全新世前期（4200-2000 cal a BP），TOC、TN、δ¹³C_org值、黏土（<4 μm）含量的低值和较高的δ¹⁵N值、高粉砂（4-64 μm）含量代表初级生产力继续降低，气候环境进一步向冷干转变。全新世以来湖泊初级生产力的逐渐下降反映了季风的逐步减弱，而逐渐减少的30°N夏季太阳辐射是驱动季风减弱的主要因素。晚全新世后期（2000 cal a BP至今），各环境代用指标的变化表现出不同于全新世环境演化趋势的异常，说明湖泊环境及沉积物受人类活动的影响加剧。     

林下植被和凋落物对寒温带森林生长季土壤CH4通量的影响

为进一步探究林下植被和凋落物管理对我国寒温带森林生长季土壤CH₄通量的影响,采用静态箱-气相色谱法对大兴安岭北部4种林型（白桦林、山杨林、樟子松林和兴安落叶松林）4种处理（自然状态、去除凋落物、去除林下植被以及去除林下植被和凋落物）的土壤CH₄通量排放特征进行观测研究。结果表明：该地区森林生长季土壤均表现为CH₄的汇,4种林型不同处理后土壤CH₄通量表现为单峰变化趋势,吸收峰值出现在7月或8月。自然状态4种林型土壤CH₄平均吸收通量表现为白桦林（-79.23±14.92）μg m^-2 h^-1>山杨林（-64.27±9.60）μg m^-2 h^-1>樟子松林（-62.54±15.48）μg m^-2 h^-1>兴安落叶松林（-48.73±12.26）μg m^-2 h^-1,兴安落叶松土壤CH₄平均吸收通量显著小于其他三种林型（P<0.05）。相比于自然状态,4种林型在去除凋落物后土壤CH₄吸收通量提高了2.12%-12.15%,但变化幅度均没有达到显著水平（P>0.05）。去除林下植被后4种林型CH₄吸收通量提高了0.84%-20.55%,且只有山杨林吸收增加达到显著水平（P<0.05）。同时去除林下植被和凋落物后,对白桦林和樟子松土壤CH₄通量影响不显著（P>0.05）,但对山杨林和兴安落叶松林影响显著（P<0.05）。总之,去除凋落物或林下植被均会提高土壤对CH₄吸收,去除林下植被对土壤CH₄通量的影响要大于去除凋落物的影响,但不同林型不同处理之间还存在差异。     

氮磷添加对荒漠草原植物-凋落物-土壤生态化学计量特征的影响

为明确植物、凋落物和土壤养分含量及化学计量比对土壤中添加多种限制性养分的响应，阐明"植物-凋落物-土壤"连续体化学计量动态及各组分之间的协同作用，以宁夏荒漠草原为研究对象，于2018年开始进行氮（N）、磷（P）养分添加控制试验。试验处理包括对照（CK）、N添加、P添加、NP共同添加4个处理。结果表明：（1） NP共同添加显著增加了荒漠草原植物N和P含量、以及凋落物和土壤P含量，显著降低了荒漠草原植物C：N和C：P、以及土壤和凋落物C：P和N：P。P添加显著增加了荒漠草原植物、凋落物和土壤P含量，显著降低了植物、凋落物、土壤C：P和N：P。N添加分别增加了植物、凋落物N含量和N：P，但对植物N含量影响未达到显著水平。（2） C、N、P含量和N：P大小均表现为植物 > 凋落物 > 土壤，C：N和C：P均表现为凋落物 > 植物。（3） N添加提高了荒漠草原植物对P再吸收效率，降低了荒漠草原植物对N利用效率；P添加提高荒漠草原植物对N再吸收效率，降低荒漠草原对P的利用效率；NP共同添加提高了荒漠草原植物对N和P再吸收效率，降低了荒漠草原植物对N和P利用效率。（4）植物-凋落物-土壤的N、P含量和化学计量比之间显著相关，其中植物N、P、N：P与凋落物和土壤N、P、N：P显著正相关，凋落物P、C：N与植物和土壤C：P、N：P显著负相关。（5）荒漠草原植物和凋落物N较稳定（1/H=0.45和1/H=0.48），而植物和凋落物P、N：P较敏感（1/H=0.80、0.73和1/H=0.81、0.78）。荒漠草原植物生长受N限制，N添加缓解荒漠草原植物N限制，P添加和NP添加加剧荒漠草原植物N限制，荒漠草原植物通过改变养分利用策略和再吸收利用效率适应土壤中N、P含量的变化。     

PRGDWR-尿激酶原双功能嵌合分子的性质研究

为赋予单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single chain urokinase-type plasminogen activator, scu-PA, 尿激酶原)以抗血小板聚集的功能,在scu-PA的kringle区118位Gly与119位Leu之间插入PRGDWR序列（insert mutant B,InB）.利用甲醇酵母（Pichia pastoris）进行分泌表达,经金属离子螯合亲和层析与S强阳离子交换层析,得到纯蛋白.实验测定InB对人工合成底物S-2444的酰胺解活性为5 900 IU/mg,动力学常数为：K_m,S-2444^InB=56.8 μmol·L^-1,k_cat,S-2444^InB=0.33 s^-1;水解天然底物plasminogen的动力学常数为：K_m,plg^InB=0.397 μmol·L^-1,k_cat,plg^InB=0.0164 s^-1.InB激活plasminogen的反应在有fibrin存在条件下InB的活性为无fibrin条件下的46.3％.该突变体在体外激活plasminogen的活性与同一系统表达的野生型scu-PA基本相同.该突变体表现出较强的抗血小板聚集活性,IC₅₀＝12.7 μmol·L^-1,而野生型scu-PA无此功能.实验表明scu-PA的K区插入突变体InB是一种极具潜力的双功能溶栓分子.     

亚热带次级森林演替过程中模拟氮磷沉降对土壤微生物生物量及土壤养分的影响

氮（N）沉降深刻影响着森林生态系统的生物多样性、生产力和稳定性。亚热带地区森林土壤磷（P）的有效性较低,N沉降将更突显P的限制作用。N、P输入对亚热带次级森林土壤的影响是否依赖于森林演替阶段知之甚少。选取两种不同演替年龄阶段（年轻林：<40 a;老年林：>85 a）的亚热带常绿阔叶林,设置模拟N和/或P沉降（10 g m^-2 a^-1）4个处理（Ctrl、N、P、NP）,连续处理4.5年后采集表层、次表层和下底层（0-15、15-30、30-60 cm）土壤样品,综合分析了土壤微生物生物量碳（MBC）氮（MBN）和多种土壤养分含量。结果表明,MBC、MBN及土壤养分含量均随土壤深度增加而降低。N添加对两种演替阶段森林土壤中MBC和MBN均无显著影响。施P相关处理（P和NP）对年轻林表层土壤MBC和MBN无显著影响,但显著增加了老年林表层土壤MBC和MBN（P<0.05）,表明老年林可能比年轻林更易受P限制。N添加显著增加了两种演替森林表层土壤可溶性有机氮（DON）、氨态氮（NH₄⁺-N）和硝态氮（NO₃^--N）的含量（P<0.05）;P相关处理（P和NP）显著增加两种演替阶段表层和次表层土壤速效磷（AP）以及表层土壤全磷（TP）的含量（P<0.05）。土壤MBC和MBN与土壤中各养分指标（可溶性有机碳DOC、DON、NH₄⁺-N、NO₃^--N、AP、全碳TC、全氮TN和TP）呈显著正相关关系,土壤TC、TN和DOC是影响土壤微生物生物量的主要因子。研究可为评估和揭示未来全球环境变化背景下不同演替林龄亚热带森林的土肥潜力及土壤质量的演变提供一定的科学理论依据。     

滇中亚高山地带性植被凋落物分解对模拟氮沉降的响应

模拟氮（N）沉降对凋落物分解特征的影响对研究森林生态系统物质循环响应大气N沉降的内在机理和应对N沉降全球化具有重要意义。从2018年2月至2019年1月，对滇中亚高山常绿阔叶林（Evergreen broad-leaf forest）和高山栎林（Quercus semecarpifolia forest）两种地带性植被进行模拟N沉降试验，利用尼龙网袋法对两种林型凋落叶和凋落枝进行原位分解试验，N沉降处理水平分别为对照CK（Control check，0 g N m^-2 a^-1）、低氮LN（Low nitrogen，5 g N m^-2 a^-1）、中氮MN（Medium nitrogen，15 g N m^-2 a^-1）和高氮HN（High nitrogen，30 g N m^-2 a^-1）。结果表明：常绿阔叶林凋落叶和凋落枝分解率分别为44.84%和21.96%，均高于高山栎林的35.97%（凋落叶）和17.51%（凋落枝）；N沉降处理使得常绿阔叶林和高山栎林的凋落叶和凋落枝质量损失95%的时间在对照（CK）的基础上均有一定程度的增加，其中以HN处理下最为显著；经过1年的分解，两种林型凋落叶、枝纤维素和木质素降解均受到N沉降的抑制作用；两种林型中凋落物质量残留率、纤维素和木质素残留率三者间呈极显著正相关。针对滇中亚高山区域范围内的两种地带性植被，凋落物分解对N沉降的响应方向主要取决于凋落物基质质量，其中尤以纤维素和木质素为重要影响因素。     

重组中国汉族人源γ-干扰素的纯化和鉴定

在E.coli中高表达的中国汉族人源γ-干扰素是以包涵体的形式存在的,包涵体经各种溶液洗涤后,用8 mol/L尿素裂解,裂解上清在8 mol/L尿素存在下,经离子交换柱层析和凝胶过滤两步纯化,得到纯度大于95%的γ-干扰素,稀释复性后,其比活为5.5×10⁵ U/mg. 激光解析电离质谱分析表明,中国汉族人源γ-干扰素的分子质量为17.32 ku,其N端序列与Gray等报道的γ-干扰素N端序列一致.中国汉族人源γ-干扰素的氨基酸组成分析结果也与其理论值相吻合.     

悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的实验研究

利用5L生物反应器悬浮培养HEK-293 N3S细胞生产携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus-green fluorescent protein,Ad-GFP),为规模化生产腺病毒基因药物建立一种稳定可行的生产工艺。复苏的种子细胞进行逐级放大最后接入5L搅拌式生物反应器中,采用含5％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培基灌流培养293 N3S细胞,当细胞密度达到(2～4)×10⁶个/mL时感染Ad-GFP,48h后收获细胞,经两步氯化铯超速离心获得纯化的Ad-GFP。采用紫外分光光度计比色法和高压液相色谱法（HPLC）测定病毒颗粒数和纯度,采用组织培养半数感染剂量（TCID₅₀）法检测腺病毒的感染滴度。连续培养10～12d,细胞密度可达到(2～4)×10⁶6个/mL左右,纯化的Ad-GFP感染滴度和颗粒数分别为1.0×10¹¹IU/mL和1.68×10¹²VP/mL,比活性为6.0%,A₂₆₀A₂₈₀比值为1.33,产品纯度达到99.2%。建立了5L生物反应器悬浮培养293 N3S细胞生产重组腺病毒Ad-GFP的生产工艺,对携带其他基因的重组腺病毒药物生产具有一定的指导意义。