稳定携带H5亚型禽流感病毒候选DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及其免疫原性

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-HA扩增出禽流感病毒JSGO(H5N1)株的血凝素(HA)基因,将其克隆入真核表达质粒pmcDNA3.1 中,获得重组表达质粒pmcDNA3.1-HA。通过电穿孔转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207*,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)。经体内体外试验证实,重组质粒pmcDNA3.1-HA在沙门氏菌中的稳定性显著高于pcDNA3.1-HA。将重组菌SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)分别以2×109CFU剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可产生针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体。重组菌以5×109CFU剂量两次口服免疫试验鸡,免疫鸡的小肠样品中可测到针对禽流感病毒HA蛋白的黏膜抗体,且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的抗体效价高于SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组。免疫保护试验结果显示,SL7207*(pmcDNA3.1-HA)和SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组的免疫保护率均与空载体组之间存在显著性差异(P<0.05),且SL7207*(pmcDNA3.1-HA)免疫组的保护率较SL7207*(pcDNA3.1-HA)免疫组提高了22.6%,说明稳定携带H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌具有良好的免疫原性和免疫保护性。     

稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白细胞的构建

获得稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞株。采用RT-PCR方法扩增乙型流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建pcDNA3.1(+)-HA重组质粒。将已鉴定正确的pcDNA3.1(+)-HA质粒与辅助质粒PLV-EF1a-EGFP(2A)Puro通过脂质体介导法共转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选后得到重组细胞株HEK293-HA,通过流式细胞术法(FCM)来检测细胞中HA的表达情况。所得到的重组细胞经扩大培养后再连续培养15代,采用间接免疫荧光法(IFA)和蛋白免疫印迹法(WB)来检测HA蛋白表达的稳定性。结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)-HA经双酶切及测序鉴定正确;共获得3株高表达阳性细胞株。细胞扩大培养后连续传代培养15代后进行Western blot和IFA检测结果表明,重组细胞的HA蛋白得到稳定的表达。已成功获得了能稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞,可为乙型流感病毒HA蛋白的进一步研究提供良好的基础。     

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a( )的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果。     

GM-CSF作为Ⅱ型登革病毒E蛋白免疫佐剂的免疫效果观察

目的观察粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)作为II型登革病毒E蛋白免疫佐剂的保护效果,评估GM-CSF作为蛋白疫苗免疫佐剂的可行性。方法提取GM-CSF质粒(pCAG-GM)、将表达II型登革病毒E蛋白的重组质粒(E/pGEX-6P-1)进行诱导,表达产物用亲和层析纯化。将BALB/c小鼠随机分为E蛋白组、佐剂组(E蛋白+GM-CSF)和对照组进行免疫,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体终点效价;采用蚀斑减少中和试验(PRNT)检测II型登革病毒中和抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠免疫后细胞因子的水平;用攻毒试验观察各组小鼠保护率。结果 E蛋白组和佐剂组小鼠血清中抗体终点效价、中和抗体水平均在免疫后有一定的升高,差异无统计学意义(P0.05);佐剂组细胞因子(IFN-γ和IL-10)水平较E蛋白组均有明显上升,差异具有统计学意义(P0.05);但攻毒试验显示,佐剂组小鼠全部死亡,生存率为0,而E蛋白组的小鼠保护率为33%。结论 GM-CSF免疫佐剂可抑制II型登革病毒E蛋白的免疫保护作用,其作为蛋白疫苗免疫佐剂仍需慎重。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

人tPA信号肽和Yersinia Pestis保护性抗原F1-V融合基因的构建及其免疫效果观察

为获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因以及人tPA信号肽基因的重组质粒tPA-pVAX1/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力, 用PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pVAX1/F1-V融合重组质粒.PCR扩增tPA信号肽片段并将其插入到F1-V的上游,构建tPA-pVAX1/F1-V融合重组质粒;转染COS-7细胞,Western blot法鉴定目的蛋白的表达.重组质粒tPA-pVAX1/F1-V加GM-CSF佐剂免疫BALB/c小鼠,观察免疫效果.400个LD50强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率.结果表明,tPA-pVAX1/F1-V在COS-7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体;抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明,所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主;&#61472;攻毒保护率达90%.结果提示,已成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体tPA-pVAX1/F1-V,且具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力, 对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础.     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。     

流感病毒NP表位序列增强H7N9 HA DNA疫苗免疫效果研究

为增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,本文构建了含有流感病毒NP的5个重复优势T表位或B表位(包括B_1线性表位和B_2构象表位)的表达质粒(简称NPT和NPB),以小鼠为动物模型,将NPT和NPB分别与H7N9流感病毒HA DNA混合免疫BALB/c小鼠1次,21 d后用致死剂量(20 LD_(50))的H7N9流感病毒攻击小鼠。通过检测免疫后小鼠血清特异性抗体滴度和攻毒后的免疫保护性指标-存活率、肺部残余病毒滴度及体重丢失率,评价表位质粒与HA DNA疫苗混合免疫对小鼠的保护效果。试验结果表明:用致死性H7N9流感病毒攻击小鼠后,HA DNA组小鼠全部死亡,HA+NPT免疫组小鼠存活率达到100%,HA+NPB1和HA+NPB2免疫组,小鼠存活率分别为30%和75%;混合免疫HA+NPT后小鼠抗体滴度升高明显,攻毒后小鼠体重丢失明显降低。综上表明,含有5个NP优势T表位或B表位的表达质粒能增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,混合免疫一次可以使小鼠得到较好的保护。HA DNA和表位疫苗的混合免疫,节约了疫苗用量,降低了免疫成本,为流感病毒核酸疫苗的临床开发提供了一定的试验基础。     

猪源A组轮状病毒重组质粒pW425et-Vp7在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

[目的]在乳酸菌中表达猪源A组轮状病毒重组质粒pW425et-Vp7,并检测其抗原性,为进一步制备猪轮状病毒乳酸菌疫苗奠定基础.[方法]摸索电转化条件,将已构建的重组质粒pW425et-Vp7转化至thyA基因缺陷型的嗜酸乳杆菌中.筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE和Westernblot检测其表达情况.并将BALB/c小鼠口服免疫该重组菌,间接ELISA检测其免疫原性.另外,给免疫后小鼠攻以纯化的猪轮状病毒(蛋白含量15 mg/mL),初步检测该重组菌的免疫保护作用.[结果]Vp7基因在乳酸菌中获得表达,大小约40.77 kDa,且该蛋白可与猪轮状病毒抗体反应,具有反应原性.ELISA检测小鼠肠黏膜样品结果显示免疫后小鼠能产生明显的抗轮状病毒SIgA抗体,表明该重组菌具有较好的免疫原性.且攻毒后,免疫组仅23%的小鼠发生腹泻,初步证明该重组菌对猪轮状病毒的攻击具有较好的保护作用.[结论]在乳酸菌中成功地表达了猪轮状病毒Vp7基因,制备了猪轮状病毒Vp7重组乳酸菌,该重组菌具有较好的抗原性,初步证明其作为疫苗的可行性.     

金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)凝集因子A(ClfA)免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌Newman、Wood46和HLJ23-1株的clfa基因并进行序列分析,再将Newman株的clfa基因插入到pQE-30载体上,导入宿主菌Escherichia coli M15(pREP4)并诱导表达和纯化ClfA重组蛋白。用纯化的ClfA免疫小鼠,检测血清中抗体和细胞因子水平,首次免疫后35 d时用金黄色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1、Newman株对小鼠攻毒。结果发现:clfa基因序列高度保守;ClfA重组蛋白在E.coli M15中获得表达;在首次免疫后35 d时血清抗体效价和细胞因子浓度与对照组相比,均显著升高(P<0.05);攻毒结果为蛋白免疫组小鼠获得一定的免疫保护。由此表明,ClfA重组蛋白有较好的免疫原性和免疫保护力。     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白疫苗的免疫安全性研究

将呼吸道合胞病毒(respiratory syncytical virus,RSV)G蛋白与CpG佐剂共同免疫小鼠,分析RSV G蛋白免疫原性及安全性。前期纯化的G_(CX3C)和G_(CTL)两种蛋白分别与CpG佐剂混合,在0、2、4周以肌肉注射方式免疫昆明小鼠,免疫结束后检测小鼠肺部匀浆液中的IFN-γ、IL-4及Ig E等指标。同时末次免疫结束后,小鼠用滴度105pfu的RSV进行攻毒,解剖分离小鼠肺部,制备病理切片进行观察。G_(CTL)蛋白免疫组肺部匀浆液中的IL-4以及IgE低于G_(CX3C)蛋白免疫组。CpG组及GCTL+CpG组肺组织匀浆液中的INF-γ含量以及INF-γ/IL-4比值显著高于其他组(P0.05),且ELISPOT实验表明CpG佐剂能够促使分泌INF-γ的脾淋巴细胞数量增多。攻毒后,通过肺部组织切片观察,发现PBS和CpG免疫组肺部病变极为严重,G_(CTL)+CpG组的病变程度比G_(CX3C)+CpG组严重,而G_(CX3C)组的病变情况比G_(CTL)组严重。这些结果表明,重组G_(CTL)蛋白能够降低动物免疫应答的Th2型极化,具有良好的安全性。     

以结核杆菌hsp70为载体的“通用型”禽流感疫苗构建及免疫效力研究

化学合成H5N1亚型禽流感病毒M2蛋白N端胞外域基因序列3拷贝基因(3M2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建表达载体pET-3M2e 与pET-3M2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导重组蛋白获得表达,通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,利用Western blot鉴定重组蛋白免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫20日龄的禽流感非免鸡,以人工合成的M2e与KLH偶联后免疫鸡作为阳性对照,以pET-32a(+)载体蛋白注射组作为阴性对照,初免后2周加强免疫。通过抗M2e抗体检测、 细胞病变抑制试验与间接免疫荧光试验评价重组蛋白免疫后产生的体液免疫反应; 利用流式细胞分群及细胞因子产量检测评价重组蛋白免疫后产生的细胞免疫反应。加强免疫后4周用100EID50的H9N2亚型AIV攻毒,通过Real-time PCR检测攻毒后3、5、7天免疫鸡泄殖腔棉拭子中病毒的含量。结果表明,重组蛋白3M2e hsp70免疫组能够刺激免疫鸡产生较高的抗体水平及细胞免疫应答,并且攻毒后泄殖腔棉拭子中病毒含量明显降低。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达

目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以10⁹PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果     

金黄色葡萄球菌isdb基因的克隆表达及其小鼠免疫试验

为了研究金黄色葡萄球菌表面Isdb蛋白的免疫原性,应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌Wood46株的isdb 基因并进行序列分析,再将isdb 基因插入到pET32-a(+) 载体上,构建了pET32-a(+)-isdb重组质粒,将重组质粒转化到宿主菌大肠埃希菌BL21中并诱导表达和纯化Isdb蛋白。用纯化的Isdb蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清中抗体水平;在二次免疫之后的第2周,用金黄色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1株对小鼠攻毒,每组8只小鼠。研究结果发现：isdb基因在不同菌株中高度保守;Isdb蛋     

由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究

目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@uV),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用

根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA。重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白。表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐剂混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以10⁹PFU同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果。结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1∶12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1∶200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著。表明pilA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果     

B型流感病毒血凝素的表达及免疫原性测定北大核心CSCD

B型流感病毒是引起季节性流感的原因之一,严重时会造成重大疾病或死亡。为了检测B型流感病毒2个疫苗候选毒株的血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白胞外段在哺乳动物细胞中的表达及在小鼠体内的免疫原性,本研究将带有三聚体标签的HA胞外段(HA-ectodomain,HA-ecto)序列及神经氨酸酶(neuraminidase,NA)全长编码框经密码子优化后构建至pCAGGS载体中,通过线性聚乙烯亚胺将pCAGGS-HA-ecto与pCAGGS-NA共转染293T细胞。收集转染后96h的上清,通过镍离子亲和层析及分子筛层析获得三聚体形式的HA-ecto蛋白,然后将HA-ecto三聚体蛋白免疫小鼠,进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)及血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HAI)检测HA-ecto蛋白诱导小鼠后产生的抗体水平。纯化结果显示,通过哺乳动物细胞表达系统能够得到分泌型表达的三聚体HA-ecto蛋白。ELISA及HAI结果显示,三聚体HA-ecto蛋白二次免疫小鼠后,能诱导小鼠产生较高水平的同源和异源交叉抗体。以上结果表明,哺乳动物细胞表达的B型流感病毒HA蛋白可作为亚单位重组流感疫苗的候选。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。