菜白蝶非包涵体病毒感染叙利亚金地鼠肾上皮细胞系(BHK_p 925)的研究

昆虫病毒感染体外培养的哺乳动物细胞,获得成功的有大蜡螟(Galleria mellonella)浓核病毒(Densonucleosis Virus)感染小白鼠L细胞和大白鼠胚成纤维细胞,家蚕核型多角体病毒的DNA感染人羊膜FL细胞。我们从罹病死亡的菜白蝶(Pieris rapas L.)虫体中分离到的一株非包涵体病毒感染BHKp 925上皮细     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株结构蛋白的生物信息学比较分析

运用生物信息学方法将家蚕浓核病毒中国(镇江)株的结构蛋白与其它类型家蚕浓核病毒的结构蛋白在理化特性、结构、功能等方面进行了比较分析。结果表明:家蚕浓核病毒结构蛋白是一类稳定的亲水性蛋白,BmDNV-ZJ与BmDNV-2的结构蛋白性质可能比较类似,而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列的理化性参数、序列内部重复片断以及折叠区域差异较大,表明这两种浓核病毒结构蛋白在性状、结构、功能上有较大差异。而BmDNV-ZJ和BmDNV-1结构蛋白序列中有3个不同的LCR功能区域。分子进化聚类分析可得到四大类浓核病毒结构蛋白。     

家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达

利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因,将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接,转化BL21 star菌并在该菌中表达,经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白,纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体.同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBae-HTb-eGFP中,转化BmDH10BAC感受态细胞,提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫.家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光,经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致,说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解.降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白.     

家蚕浓核病毒DNV-3（中国株）的VD2基因组序列分析

浓核病毒BmDNV-3(中国株)基因组中含有两种不同的单链线形DNA分子(VD1,VD2)。该病毒的VD2被分离、纯化、克隆到pUC119载体上,并完成了VD2全基因组序列的测定。序列分析显示:VD2全基因组长为6022个核苷酸,末端拥有524个核苷酸反向重复序列(ITRs)。VD2基因组正链含有2个大的开放阅读框,负链含有1个小的开放阅读框。计算机分析推测该基因组正链上开放阅读框(ORF1)及负链上开放阅读框(ORF3)主要编码病毒的非结构蛋白,而正链上开放阅读框(ORF2)主要编码病毒的结构蛋白。比较BmDNV-3 VD2和BmDNV-2(Yamanashiisolate)VD2基因组全序列,两者同源性达97.7%,并且有132个碱基的替代1、1个碱基的删除和2个碱基插入。研究结果显示BmDNV-3 VD2和BmDNV-2 VD2有很近的亲缘关系,但也发生一定的变异,这为更好地理解浓核病毒种类的多样性,也为研究家蚕浓核病毒进化提供了有益的线索。     

浓核病毒感染早期家蚕血液、中肠蛋白表达差异比较分析

为了探明在浓核病毒镇江株(BmDNV-ZJ)侵染早期,家蚕部分组织蛋白所产生的免疫抵抗性变化机制,本实验采用差异蛋白质组学技术研究分析了BmDNV-ZJ感染早期,家蚕的中肠、血液组织中特异性表达的差异蛋白.实验结果表明:在浓核病毒侵染初期,感受性家蚕的中肠组织受病毒感染而得到特异性表达的蛋白可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基抗氧化酶蛋白,前者具有调控蛋白酶活性和细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化的作用.血液组织受病毒感染诱导而产生的蛋白可能是丝裂原活化蛋白激酶和类抗氧化酶蛋白,前者具有调控细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化、消除自由基作用.由于试验中所得的差异蛋白点很少,这表明在BmDNV-ZJ感染早期,蚕体对浓核病毒的感染而产生的反应很小.蚕体可通过被侵染的中肠组织(浓核病毒感染的靶部位)以及血液(免疫组织)共同产生一些抗氧化或调控细胞凋亡的酶蛋白等来抗击浓核病毒的侵染.     

家蚕二分浓核病毒感染家蚕后的释放动态研究

【目的】研究家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)感染家蚕后不同时间段内释放到环境中的病毒量,为通过蚕沙快速检测病毒提供方法和依据。【方法】选取家蚕二分浓核病毒基因组节段VD1上的ns1基因和VD2上的ns3基因中的一小部分片段,分别克隆到p MD18-T载体上,制备标准品质粒,并用实时荧光定量PCR的方法绘制ns1和ns3的标准曲线。通过检测Bm BDV感染5龄家蚕后不同时间蚕沙中的病毒量来衡量释放到环境中的病毒的变化动态。【结果】在病毒感染家蚕第3天,大量的病毒随蚕沙释放到环境中,每微克蚕沙中约含1.38×106个VD1,6.54×105个VD2;从感染后第5天开始,释放到环境中的病毒量呈指数型增加;第7-8天病毒的释放量到达一个平台期,此时每微克蚕沙中约有2.12×107个VD1,1.34×107个VD2。普通PCR结果也反应出了类似的病毒释放动态。【结论】根据Bm BDV感染家蚕后的释放动态,推测病毒的复制周期约60 h。利用实时荧光定量PCR检测蚕沙中的Bm BDV,能简单、快速、准确地诊断病毒的感染。     

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

家蚕浓核症病毒感染昆虫细胞系的电镜观察

本实验首次用中国株家蚕浓核症病毒感染三株昆虫细胞系:油桐尺蠖卵巢细胞系(BS-484)、甘兰夜蛾卵巢细胞系(NIAS—MB—19)和秋粘虫卵巢细胞系(IPLB—SF—21)。结果仅在BS—484细胞中观察到病毒感染引起的细胞病变效应。电镜观察发现在感染的BS—484中,细胞核明显膨大,其中核仁活性化,数目增多,同时还观察到核仁膨大和分裂现象。感染5—6天,可看到成熟病毒粒子于核内形成。在感染的细胞质中,线粒体肥大且失去脊,粗面内质网变成小泡体,其内积累大量核糖核蛋白体。许多细胞器空泡化或退化,细胞质中出现一些包含退化细胞器的大型自身吞噬体。     

伊蚊浓核病毒三维结构的比较分析

细小病毒是目前已知的结构最小的病毒, 其宿主范围很广. 利用冷冻电镜和三维重构技术获得了伊蚊浓核病毒1.2 nm分辨率下的三维结构, 并利用计算机生物信息处理技术和氨基酸序列比对技术比较了该病毒和其他细小病毒的结构和序列的异同. 尽管均属于浓核病毒亚科, 但是无论从衣壳结构还是其蛋白质的氨基酸序列上, 伊蚊浓核病毒和其他昆虫的细小病毒都有很大差异. 相比之下, 伊蚊浓核病毒和人类B19细小病毒的衣壳蛋白相似性较大, 两者的结构蛋白和非结构蛋白一致性也高于伊蚊浓核病毒与其他昆虫的细小病毒的一致性. 此结果表明: 伊蚊浓核病毒和人类B19细小病毒有着密切关系, 前者可能来源于B19病毒的较近期变种.     

Expression of non-structural protein NS3 gene of Bombyx mori densovirus （China isolate）

The invertebrate parvovirus Bombyx mori Densonucleosis Virus type 3 (China isolate),named BmDNV-3,is a kind of bidensovirus.It is a new type of virus with unique replication mechanisms.To investigate the effects of the NS3 gene during viral DNA replication,a pair of primers was designed for amplifying NS3 gene of Bombyx mori densovirus (China isolate).Gene NS3 amplified was cloned into a prokaryotic expression vector pET-30a and the donor plasmid pFastBacHTe,respectively.The NS3 protein was expressed in Escherichia coli BL21.The pFastBacHTe-NS3 was transformed to E.coli DH10Bac.The recombinant bacmid baculoviruses (rBacmid-EGFP-NS3)isolated from the white colonies were transfected into BraN-4 cells using a transfection reagent.BmN-4 cells were infected with recom-binant virus to express fusion proteins.The expression of fusion protein around 30 kDa in E.coli BL21 was identified by SDS-PAGE,Western blotting,and mass spectrometry.The expressed NS3 protein by B.mor/nucleopolyhedrovirus bacmid system was confirmed byWestern blotting using an anti-NS3 polyclonal antibody.And about 45 kDa protein was found.The expressed fusion protein was smalleithan the expected size of EGFP-NS3,55 kDa.Western blotting analysis indicated that EGFP-NS3 protein was expressed in infected lar-vae with smaller molecular size.     

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK, EC2.7.1.35）是维生素B₆关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA (GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894 bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1 kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。     

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2 的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。     

家蚕天蚕素cDNA原核表达及抗菌活性检测

采用RT-PCR方法从家蚕Bombyx mori新疆品种新蚕三号组织中扩增天蚕素cDNA片段,回收并克隆至Pmd18-T载体,进行序列分析。基因序列分析结果与已发表的天蚕素B的序列同源性为98%,表明所克隆的新疆家蚕天蚕素cDNA为独特的cDNA片段。将天蚕素基因与Pgex-4T-1融合表达载体中的谷胱甘肽转移酶基因融合,在大肠杆菌中表达, 结果表明经IPTG 诱导30 min后,pGEX-4T-1/天蚕素转化后的大肠杆菌生长明显受到抑制;当诱导210 min 后,大肠杆菌数量又开始增加,逐渐恢复至正常水平。说明天蚕素与谷胱甘肽转移酶基因融合表达后,在IPTG存在的短时间内仍然对原核细胞有较强的抗菌抑杀作用。     

家蚕MLP基因的克隆及其结构分析

利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA电子序列, 经RT-PCR生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。MLP基因cDNA长2 327 bp, ORF全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。该MLP基因组DNA含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG剪切模式。MLP基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI)为8.29。通过BLAST分析发现该基因编码的家蚕肌肉LIM蛋白, 含有5个保守的LIM结构域, 家蚕的另一种LIM蛋白(AAR23823)含一个LIM结构域, 两者可能是通过可变剪切产生; 后者可能通过竞争作用调节前者在肌细胞中的功能。MLP的克隆为进一步研究其体内功能奠定了基础。     

Cloning and characterization of a novel gene cry9Ec1 encoding lepidopteran-specific parasporal inclusion protein from a Bacillus thuringiensis serovar galleriae strain

A novel delta-endotoxin gene from a lepidopteran-specific Bacillus thuringiensis serovar galleriae strain was cloned, and the full sequence of the cry gene was determined. The cloned 6.5-kb DNA fragment included the full sequence of the cry gene and three open reading frames located upstream of the cry gene. The gene, designated cry9Ec1, encodes a polypeptide of 1154 amino acid residues with a predicted molecular weight of 130 237. The deduced amino acid sequence of the Cry9Ec1 protein had the highest homology (77.7%) with the Cry9Ea1 protein when compared with existing Cry proteins. The expression, in an acrystalliferous B. thuringiensis strain, of the cry9Ec1 gene was high when controlled by the cyt1A2 promoter, leading to the formation of large spherical inclusions. The purified crystals from the recombinant strain were toxic when tested against two lepidopteran species, Bombyx mori and Plutella xylostella. However, the Cry9Ec1 protein gave no toxicity against Spodoptera litura, Spodoptera exigua, Plodia interpunctella, Helicoverpa zea, and Culex pipiens molestus.     

家蚕抗菌肽CMIV基因结构改造及表达产物的研究

参照天然抗菌肽ＣＭＩＶ组分的氨基酸序列,作了近５０％的改动,根据大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成了抗菌肽基因片段．将人工合成的抗菌肽类ＣＭＩＶ基因先重组到测序载体ｐＵＣ１１８上,经过序列分析,发现克隆于载体ｐＵＣ１１８上的基因片段与设计的序列完全一致．再将该基因片段重组到表达载体ｐＥＴ２８（ａ）上,抗菌肽以融合蛋白的形式表达．融合蛋白经镍－金属离子胶亲和层析纯化后,再用ＣＮＢｒ裂解,最终产物具有与天然抗菌肽相同的生物学活性