人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞

采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化,得到了高比例的神经前体细胞(97.5±0.83)%(P<0.05)。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。在长期的传代培养中发现,随着培养时间的延长,nestin阳性的神经前体细胞比例下降,同时发育能力也发生了变化。在传代培养的早期,神经前体细胞发育为神经元的比例很高,几乎没有胶质细胞分化出来。随着培养时间的延长,胶质细胞的比例逐渐上升。这与体内神经系统的发育过程非常相似。进一步研究发现具有bHLH(basic helix-loop-helix)结构域的转录因子neurogenein2(Ngn2)和Olig2可能在这一变化中起重要作用。因此,人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式,为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。     

小鼠胚胎干细胞分化扩增期连续低密度传代对原始细胞中Oct-4阳性细胞比例及神经分化能力的影响

目的：探讨在分化扩增期采用连续低密度传代的方法是否能降低小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的前体细胞中Oct-4阳性细胞的比例,以及对神经分化能力的影响。方法：采用“五步法”将小鼠胚胎干细胞向神经元分化,进入扩增期后采用连续低密度传代的方法连续传10代。然后应用细胞免疫组化鉴定Oct-4阳性细胞、神经元与胶质细胞、流式细胞仪检测Oct-4阳性细胞比例、凋亡试剂盒测定细胞凋亡。结果：流式细胞仪检测出扩增期连续低密度传代得到的前体细胞中Oct-4阳性细胞的比例由16.17±4.8％降至4.33±1.63％,扩增期低密度传代细胞和正常高密度传代细胞的细胞凋亡率鉴定分别为15.16±3.64% 和11.88±2.63%,步骤5诱导分化后的细胞GFAP和Tuj-1免疫组化染色呈阴性。结论：低密度传代培养可以减少分化后Oct-4阳性细胞的比例,且该比例下降不是由Oct-4阳性细胞的凋亡引起的。同时可能是因为低密度传代培养和高密度相比引起了细胞的质变、或者改变了前体细胞向神经元分化的某种微环境,导致了前体细胞不能分化为神经细胞。提示高密度培养在前体细胞向神经元分化过程中具有重要作用,高密度和低密度培养的比较,提供了研究ES细胞向神经元分化机制的新平台和研究方向。     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 :山羊胚胎大脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

RCMV感染星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

探讨大鼠巨细胞病毒（rat cytomegalovirus,RCMV）感染大鼠星形胶质细胞后,对神经干细胞分化的影响。原代分离培养新生大鼠星形胶质细胞和胚胎海马神经干细胞,将星形胶质细胞感染RCMV后和神经干细胞在Transwell24孔共培养体系下进行共培养,同时设对照组;用免疫荧光染色等方法检测神经干细胞与感染RCMV的星形胶质细胞共培养后,其分化细胞中神经元微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2,MAP2）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibril—lary acidic protein,GFAP）的表达。结果发现,感染RCMV的星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞分化减慢,分化成的神经元和星形胶质细胞比率低于对照组,提示星形胶质细胞感染RCMV后可抑制神经干细胞的分化,可能与RCMV影响星形胶质细胞合成和分泌各种营养因子,干扰了神经干细胞的分化进程有关。     

LincRNA1230抑制小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞分化

胚胎干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞.胚胎干细胞可以模拟体内发育过程,在无外界信号分子刺激的情况下,自发向神经前体细胞分化.有研究表明,这一体外发育过程受神经分化相关转录因子和表观遗传修饰的共同调控,然而该过程中的分子机制尚不清楚.本研究发现长链非编码RNA1230(LincRNA1230)参与了小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞向神经前体细胞的分化过程.在小鼠的胚胎干细胞中过表达LincRNA1230可以显著抑制其神经分化效率;反之,干扰LincRNA1230可以提高分化效率.进一步研究表明,LincRNA1230通过结合Wdr5,降低神经分化相关基因启动子区H3K4me3的修饰水平,从而抑制相关基因的表达活性.这些发现揭示了LincRNA1230在小鼠胚胎干细胞神经分化过程中的重要作用.     

大鼠胚胎神经干细胞纹状体内移植后特性

观察大鼠胚胎神经干细胞移植入成年大鼠纹状体后的存活、迁移和分化状况。自14天胎鼠脑室下区分离获得神经干细胞,利用无血清培养基培养扩增并进行鉴定。经4～5代的扩增后,以BrdU标记的神经干细胞通过脑立体定位注射移植入成年大鼠纹状体内,然后分别于移植后2周、4周、6周和8周时做脑冰冻切片,通过免疫组织化学和免疫荧光方法检测移植细胞的数量、定位和分化情况。8周后移植细胞的检出率约16%;移植细胞向周围宿主组织有广泛的迁移表现,尤以沿着白质束向头尾方向的迁移最为显著,最远向后侧达到内囊;纹状体中移植细胞主要分化为神经元和星形胶质细胞。星形胶质细胞数量最多,主要位于移植区与宿主组织临界部位,而神经元处于移植区中央。培养的大鼠胚胎神经干细胞可以作为移植替代治疗神经退行性疾病研究的供体细胞源,而移植中的迁移现象值得注意。     

中脑神经前体细胞的体外分离、培养和特性

为了解中脑神经前体细胞的体外培养特性和建立中脑神经前体细胞的体外分化调控机制提供细胞模型。本实验采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养来源于大鼠胚胎E14.5天的中脑神经前体细胞,应用免疫细胞化学方法了解其前体细胞特性。结果发现中脑神经前体细胞呈神经前体细胞特征性标记Nestin免疫染色阳性,无分化细胞标记;细胞克隆实验证实中脑神经前体细 胞有自我更新能力;在EGF刺激下增殖迅速;当撤去EGF后置于含胎牛血清的培养基和被覆多聚赖氨酸(PLL)的培养皿内,中脑神经前体细胞可分化成神经元和星形胶质细胞。本试验证明我们培养的中脑神经前体细胞具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

胶质细胞干细胞/前体细胞特性的研究进展

胶质细胞是脑内数量最多的神经细胞,包括星形胶质细胞、少突胶质前体细胞、NG2胶质细胞等多种类型,具有维持神经系统内环境稳态、支持和营养神经元、调控神经信号传导等多种重要功能。近年来,随着研究的深入,越来越多的证据表明某些特定的胶质细胞在一定条件下表现出干细胞的特性,发挥干细胞的功能。例如,在病理损伤条件下,星形胶质细胞和少突胶质前体细胞均会被活化而出现增殖、分化,体外分离培养可自我更新形成神经球。这些活化的星形胶质细胞和少突胶质前体细胞形成的神经球能够被诱导分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。此外,通过强制性表达外源基因能将星形胶质细胞和NG2胶质细胞转分化为神经元,这可能也是其干细胞特性的一种体现。本文在已有研究的基础上,总结了放射状胶质细胞、少突胶质前体细胞、星形胶质细胞、NG2胶质细胞与其它类型胶质细胞的干细胞特性、干细胞特性形成的条件、它们可能产生的子代细胞以及涉及的分子信号调控通路。深入探讨胶质细胞的干细胞特性及生理功能,有利于促进其在神经系统损伤修复领域的临床应用。     

Sox10和Olig2加速人源性诱导多能干细胞向少突胶质前体细胞分化

少突胶质细胞(OLs)有望用于治疗多发性硬化和先天性脑瘫等脱髓鞘疾病.近年来,一些研究者利用人的胚胎干细胞和神经干细胞作为起始细胞来获得少突胶质细胞前体细胞(OPCs).然而,神经干细胞的应用受到其来源的限制;现有的将胚胎干细胞分化为OPCs的方法耗时较长.因此,本研究探讨了一种通过在人诱导多能干细胞中过表达两个转录因子(Sox10和Olig2),从而有效获得OPCs的方法.通过这种方法,可以在14天内获得PDGFRα阳性的OPCs,并在56天内获得O4阳性的OPCs.获得的OPCs在和大鼠(Rattusnorvegicus)皮质神经元共培养时能分化为成熟的少突胶质细胞并包裹轴突形成髓鞘.该研究结果在自体细胞移植领域中具有一定的应用潜力.     

神经干细胞分离培养方法的介绍

在成体的许多组织中发现了多能干细胞,这些干细胞可以进行自我复制,参与组织的正常修复。神经干细胞在体外能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,并具有多向分化潜能。成体神经干细胞和胚胎干细胞都能分化成成体神经系统中的各种神经细胞。神经干细胞具有自我更新能力,因此神经干细胞可以应用于神经损伤或者神经疾病的修复。本文概述了神经干细胞体外分离培养的方法及其生长影响因子。     

神经干细胞向神经元分化调控的研究进展

神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞,它可以通过对称分裂和不对称分裂方式产生神经组织的各类细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。中枢神经系统受到损伤后,神经元和胶质细胞的损伤导致了临床症状,内源性神经干细胞的修复作用不大,原因是干细胞的数量有限,微环境的不允许。移植的神经干细胞进入体内后,由于受到多种因素的影响,常保持未分化状态或大部分分化为胶质细胞。神经干细胞向神经元分化的调控机制及其影响因素直接决定神经干细胞源性神经元的比例和神经元之间功能性突触的数量。现就其研究进展做一综述。     

胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的分离和培养

研究采用显微解剖、无血清细胞培养和免疫荧光细胞化学染色等实验技术 ,成功地建立了胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞 (NSCs)的分离和培养方法。结果显示 ,( 1)在含成纤维细胞生长因子 2 (FGF 2 )和表皮生长因子(EGF)的无血清培养液中 ,两种来源的NSCs经体外培养 8- 10代后 ,其细胞数呈指数级增加 ,其中脑来源的NSCs数由原代培养时的 1× 10 6 增加至 1× 10 12 ,脊髓来源的NSCs数从 1× 10 6 增加至 1× 10 11。增殖的细胞表达神经上皮干细胞蛋白 (nestin) ;( 2 )在含 1%胎牛血清 (FBS)的培养条件下 ,它们都能被诱导分化为神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞。但其分化比例可随细胞传代次数的增加而改变 ,其中 ,大脑来源的NSCs分化为神经元的比例从第二代 (P2 )的 11 95± 2 5 %下降至第五代 (P5)的 1 97± 1 16% (P <0 0 1) ,而少突胶质细胞的分化比例则基本保持不变 ,这一分化格局同样可在脊髓来源的NSCs中发现。结果表明 ,我们所分离和培养的细胞在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能 ,它们都表达nestin ,属于中枢神经系统的干细胞     

成年哺乳动物海马中的星形胶质细胞可生成新的神经元

在许多脊椎动物 ,包括人的一生中 ,大脑海马齿状回都会不断生成新的神经元。这些新神经元的前体存在于海马齿状回的亚颗粒层。过去从对成年哺乳动物海马组织的培养中发现 ,干细胞能自我更新并且能生成新的神经元和神经胶质细胞 ,但它们的原始前体细胞尚不清楚 ,研究发现亚颗粒层细胞———一种具有胶质纤维酸性蛋白 (ＧＦＡＰ)免疫标记的星形胶质细胞 ,在正常情况下或在用化学方法去除活跃的分裂细胞之后 ,可分裂和生成新的神经元。我们也对一定数量小的电子致密亚颗粒层细胞 (称之为Ｄ细胞 )进行了研究 ,发现它们起源于星形胶质细胞 ,在新…     

兔胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴别

目的：研究兔胎脑神经干细胞体外生长特性,为探讨神经干细胞的临床应用及神经系统的发育奠定基础。方法：采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的N2无血清培养技术,取18天龄兔胚胎脑组织,分离神经干细胞,并观察分离的细胞体外培养、增殖、分化潜能,免疫组化鉴定。结果：从18天龄兔胎脑皮质和纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈半贴壁状态生长,形成神经球,可传代。细胞呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养基中培养时则分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论：来自兔胎脑神经干细胞能在体外培养、增殖并保持传代能力。无血清N2EGF、bFGF培养基有利于兔胎脑神经干细胞的存活和增殖,含血清培养基能诱导兔胎脑神经干细胞分化。     

星形胶质细胞诱导成年神经干细胞的神经发生

在中枢神经系统 ,成年后新神经元发生主要见于两个脑区 ,即室管下区 (ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｚｏｎｅ)与海马的颗粒下区 (ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒｚｏｎｅ)。正常情况下 ,除上述脑区外的其它脑区能够产生神经胶质细胞 ,但是不能产生神经元。为了研究神经元和 /或神经胶质细胞对来源于成年的神经干细胞分化的影响 ,Ｓｏｎｇ等分离了成年大鼠海马的神经元和星形胶质细胞 ,将其分别或联合与来自成年的、依赖ＦＧＦ 2的神经干细胞共培养 ,意外地发现神经元促进神经干细胞分化为少突胶质细胞 ,而星形胶质细胞则促进神经干细胞分化为神经…     

FEZF 1在人胚胎干细胞早期神经分化过程中的作用研究

研究模型的缺乏和人源细胞的伦理问题极大地限制了人早期神经发育机制的研究.人胚胎干细胞具有体外无限增殖和分化为人体内各种细胞的能力,为研究人神经发育提供了重要的工具.本研究利用化学成分确定的神经诱导体系和高通量筛选策略,发现Fez锌指家族1(FEZF1)在人胚胎干细胞神经分化过程中快速表达,且先于人神经前体细胞标志基因PAX6的表达,提示FEZF1是人早期神经发育中的重要调控因子.随后利用CRISPR/CAS9技术构建了FEZF1敲除的人胚胎干细胞株,发现敲除FEZF1阻碍了人胚胎干细胞的神经分化进程.此外,FEZF1敲除抑制了人胚胎干细胞神经分化过程中多能性的丢失,部分揭示了FEZF1缺失引起神经发育缺陷的机制.然而,单独过表达FEZF1并不能驱动人胚胎干细胞的神经分化,表明FEZF1是神经分化的必需调控因子,却不足以启始人胚胎干细胞的神经分化.总之,本研究发现了FEZF1是人早期神经分化的重要调控因子,为理解人神经发育奠定了理论基础.     

人类胚胎干细胞体外诱导分化为神经干细胞

人类胚胎干细胞是替代治疗充满希望的细胞来源. 描述了从人胚胎干细胞诱导分化出神经干细胞的方法. 将人胚胎干细胞系PKU1, PKU2在细菌培养皿中悬浮培养, 分化形成囊性拟胚体. 拟胚体接种至组织培养皿, 加入N2培养液和生长因子bFGF培养2周, 拟胚体贴壁、展开,中心出现灶状增生, 有突起的小细胞. 用机械方法取下此种细胞, 重新接种, 则细胞团悬浮生长,形成神经球. 培养10天后, 将神经球打散成单细胞接种, 该细胞贴壁生长旺盛. 免疫荧光检测显示为几乎100% 纯净的nestin阳性细胞. 将培养液中的生长因子撤除, 继续培养7~10天, 细胞分化为神经元, 该细胞呈现β-tubulin isotype_Ⅲ 阳性、GABA阳性、serotonin阳性、synaptophysin阳性. 在生长因子PDGF-AA诱导下, 细胞分化为星形胶质细胞, 其GFAP阳性; 或少突胶质细胞, 其O4阳性. 可见, 人类胚胎干细胞经上述方法培养可分化为典型神经干细胞, 表达神经干细胞特异的标志分子nestin、能自我更新、具有分化为神经系统三类主要细胞的能力.     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。     

人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能,是研究早期胚胎发育和细胞替代治疗的重要细胞来源.采用一种与小鼠成纤维细胞共培养的方法进行人胚胎干细胞的神经诱导,可产生高纯度的神经上皮祖细胞,其神经上皮特异性基因的表达有一定的时空性;诱导生成的神经上皮祖细胞具有增殖潜能并可分化为神经元和星型胶质细胞,是潜在的神经干细胞.人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞为研究神经发育和神经诱导提供了新材料,也为神经系统疾病的细胞替代治疗提供了新的细胞来源.