猪神经干细胞分离培养研究进展

神经干细胞用于神经学临床修复和基础理论研究的前提是首先完成神经干细胞的体外分离、培养、纯化并大量扩增。鼠、人、猪中都已成功分离出神经干细胞并已尝试用于动物神经系统损伤等疾病的治疗,尽管在鼠和人上的研究很多,相对于鼠神经干细胞在神经学临床应用上的局限和人神经干细胞在材料来源上的不便,猪作为神经干细胞临床应用和基础研究的模式动物有很大的潜力。但关于猪神经干细胞体外分离培养的研究非常少,本文对这方面的研究进展做一综述。     

兔胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴别

目的：研究兔胎脑神经干细胞体外生长特性,为探讨神经干细胞的临床应用及神经系统的发育奠定基础。方法：采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的N2无血清培养技术,取18天龄兔胚胎脑组织,分离神经干细胞,并观察分离的细胞体外培养、增殖、分化潜能,免疫组化鉴定。结果：从18天龄兔胎脑皮质和纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈半贴壁状态生长,形成神经球,可传代。细胞呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养基中培养时则分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论：来自兔胎脑神经干细胞能在体外培养、增殖并保持传代能力。无血清N2EGF、bFGF培养基有利于兔胎脑神经干细胞的存活和增殖,含血清培养基能诱导兔胎脑神经干细胞分化。     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞分离培养方法研究

为了建立经济实用的神经干细胞培养方法 ,以Wistar大鼠胚龄 1 4～ 1 5天的胚胎为实验材料 ,选取中枢神经系统的大脑和小脑神经组织 ,经 0 1 2 5 %胰酶消化处理 ,在生长因子 (aFGF和bFGF)作用下 ,采用无血清培养法进行培养。通过倒置相差显微镜进行观察 ,可观察到明显的干细胞的不对称分裂图像。神经干细胞在培养一段时间后均出现细胞团 ,细胞团贴壁后可进行分化 ,形态上表现为神经元样和神经胶质样细胞。利用激光扫描共聚焦显微镜对其进行鉴定 ,可检测到神经干细胞标志性蛋白-Nestin蛋白。采用此法可以分离得到具有干细胞特征和多分化潜能的神经干细胞 ,建立了一套神经干细胞的分离、培养和鉴定的方法 ,这将对更好地理解神经系统的发育机制 ,及临床治疗神经系统疾病具有重要意义。     

神经干细胞研究介绍

神经干细胞研究是近年脑科学研究的热点,本文综述了神经干细胞的分离培养方法、脑内迁移路线、发育分化的影响因素以及可能的应用前景。     

小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定

且的探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养方法,并获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供实验材料。方法无菌条件下分离E15天小鼠胚脑皮质,制成单细胞悬液,在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和胶质细胞分化。结论小鼠胚脑皮质存在具有多向分化潜能的神经干细胞,这些细胞可以在体外稳定培养、传代并自然分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

神经上皮干细胞的分离培养及其体外分化特性的观察

目的探讨大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的分离培养条件,并观察其在体外的分化特性.方法采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经上皮干细胞,采用巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色技术检测神经上皮干细胞,用NSE和GFAP免疫组化染色检测并计数神经细胞和神经胶质细胞.结果大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞在无血清培养基中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞构成的神经球,经传代有血清培养后分化为NSE阳性和GFAP阳性细胞,其中NSE阳性细胞占细胞总数的47.7%,GFAP阳性细胞占细胞总数的39.8%.结论胎鼠神经管神经上皮干细胞在无血清培养中可增殖和传代,在有血清培养中可分化为神经细胞和神经胶质细胞,两者之比为47.7∶39.8.     

小鼠唾液腺干细胞体外分离培养方法研究

目的:建立小鼠唾液腺干细胞体外分离培养方法。方法:从7~8周龄的C57BL/6J小鼠唾液腺分离唾液腺干细胞,采用悬浮唾液球法培养唾液腺干细胞,应用倒置显微镜动态观察细胞形态;细胞计数观察细胞生长状况;免疫荧光检测LN(层连蛋白)的表达。结果:倒置显微镜下,接种2 d后细胞(salispheres)小聚集体明显增加;接种4 d后唾液腺球直径逐渐增大,形成直径约100μm的神经球,球周围无明显刺突,存在明显细胞聚集。接种7 d后唾液腺球周围存在较多微刺,10 d后球继续增长,形状明显不同于4 d,表明处于活跃的增殖状态,唾液腺干细胞已经开始分化。生长曲线结果显示随着培养天数的增加,唾液腺球的数目呈明显递增趋势,同时,唾液腺球的直径也明显增大。免疫荧光结果显示,培养2 d后,唾液干细胞球开始表达LN,培养第4 d后,随着唾液干细胞球的增加,层连蛋白表达更明显。结论:应用该方法获得了唾液腺干细胞,具有成体干细胞的特征,具有自我更新和多向分化的潜能。     

胎鼠脊髓神经干细胞分离方法的比较

目的：比较机械法和胰酶消化法对胎鼠脊髓源神经干细胞增殖分化的影响。方法：分别用机械法和胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞,应用台盼蓝检测细胞成活率,用无血清培养技术培养神经干细胞,应用MTT法检测细胞分裂增殖能力．采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化细胞。结果：机械法获得的细胞数量多于胰酶消化法。细胞经过培养其增殖能力机械法略强于胰酶消化法,但无统计学意义。培养形成的细胞球Nestin阳性,诱导分化后可见NSE和GFAP阳性细胞。结论：运用机械法比胰酶消化法分离胎鼠脊髓组织获得神经干细胞方法简单,容易操作,经过培养细胞增殖能力较强。并可提供健康的细胞来源。     

神经干细胞的分离、培养及应用前景

胚胎和成年哺乳动物脑内均存在神经干细胞,具有潜在的增值和分化能力。在一定条件下,神经干细胞可向多个方向分化,生成神经元和神经胶质细胞,这为利用神经干细胞进行中枢神经系统退行性病变和损伤的治疗打下基础。     

人胎儿脊髓神经干细胞的分离培养

本文旨在探讨是否能够从低温保存的流产儿分离培养出脊髓神经干细胞。将14周流产儿在4℃下保存,2、6和12h后取脊髓,将颈段、胸段、腰骶段分别进行无血清培养,并用胎牛血清诱导分化。用克隆培养的方法验证培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志nestin及干细胞诱导分化后神经元标志MAP2、星形胶质细胞标志GFAP、胆碱能标志ChAT,并比较不同时间点以及不同部位分离的神经T细胞的差异。在各个时间点,从颈段、胸段、腰骶段脊髓均分离培养出具有连续增殖能力的神经球,其中腰骶段分离出的神经球数量最多,12h组各段分离出的神经球较2、6h组显著减少。各段培养中的神经球均为nestin阳性,诱导分化后均能够产生GFAP阳性星形胶质细胞、MAP2阳性神经元以及ChAT阳性胆碱能神经元。各段培养中的神经干细胞的克隆形成能力相似。以上结果表明,从低温保存的人胎儿能够分离培养出脊髓神经干细胞,这为基础研究以及未来治疗应用提供了新的细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离与培养条件的优化研究

目的:建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离培养条件,以获得群体均一、未分化状态保持良好的MSCs.方法:收集不同周龄大鼠骨髓细胞;以不同浓度Percoll密度梯度离心分离骨髓单个核细胞;以60%低糖DMEM40%MCDB201为基础培养基,培养24h去悬浮细胞;以不同接种密度传代培养;碱性磷酸酶染色和油红O染色考察MSCs向骨和脂肪组织分化的潜能.结果:采用57%Percoll液的分离效果优于70%Percoll液.6周龄(体重约180g)大鼠能在细胞分离的质和量上达到最佳效果.24h进行悬浮细胞去除、5×103/cm2接种密度传代培养,光镜和电镜显示MSCs增殖能力强,功能状态活跃,成脂成骨实验显示多向分化潜能保持良好.结论:优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养条件及改进培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的均一的MSCs.     

Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures

Cultured neural stem cells (NSCs) provide a powerful means for investigating central nervous system disease, neuron development, differentiation, and regeneration. To obtain sufficient neurospheres, subculturing is essential following establishment of the primary NSC culture. Passaging the primary neurospheres is a key issue that is often ignored. We evaluated the influence of different passaging schedules on primary cultured NSCs. Passaging was performed on day 5, 7 or 9. We observed more neurospheres with diameters of 200–250 μm on day 7 than on day 5 or 9. Prolonging the time of primary culture reduced the cell metabolic activity by the MTT assay and cell proliferation by colony-forming assay and the differentiation to neurons from cells at P2 and later decreased. Additionally, more cells were in G0/G1 phase, and higher expression of p16 ^INK4a and lower expression of cyclin D1 was found when the time of primary culture was prolonged to 9 days compared to 7-days cultures. Thus, in this study, we established that the optimal time for subculturing aggregated NSCs was on day 7 based on the primary culture.     

Cultured Rat Astrocytes Give Rise to Neural Stem Cells

Previously, we reported the occurrence of neural stem cells (NSCs) around an area of damage after rat traumatic brain injury (TBI), but it was unclear if this was due to blastgenesis in astrocytes, or to NSCs migrating from the subventricular zone (SVZ). In this study, NSCs were isolated and cultured from cultured type 1 astrocytes taken from newborn rat cortex in which the subventricular zone and hippocampus had been discarded. All cultured type 1 astrocytes showed glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunopositivity. Nestin immunopositive spheres were isolated from type 1 astrocytes and cultured in the presence of bFGF and EGF in the medium. Neurospheres differentiated into Tuj1-, GFAP- and A2B5-positive cells after 4 days of culture without bFGF and EGF. These results indicate that isolated neurospheres from brain cortex astrocytes can differentiate into neurons and glia and might contribute to neurogenesis and neuroplasticity.     

Wnt proteins promote neuronal differentiation in neural stem cell culture

Wnt signaling is implicated in the control of cell growth and differentiation during CNS development from studies of mouse and chick models, but its action at the cellular level has been poorly understand. In this study, we examine the in vitro function of Wnt signaling in embryonic neural stem cells, dissociated from neurospheres derived from E11.5 mouse telencephalon. Conditioned media containing active Wnt-3a proteins are added to the neural stem cells and its effect on regeneration of neurospheres and differentiation into neuronal and glial cells was examined. Wnt-3a proteins inhibit regeneration of neurospheres, but promote differentiation into MAP2-positive neuronal cells. Wnt-3a proteins also increase the number of GFAP-positive astrocytes but suppress the number of oligodendroglial lineage cells expressing PDGFR or O4. These results indicate that Wnt-3a signaling can inhibit the maintenance of neural stem cells, but rather promote the differentiation of neural stem cells into several cell lineages.     

神经干细胞脑内移植后的存活、迁移和分化

从胚胎或成体大鼠脑组织、人胚脑组织均能分离到神经干细胞 ,将它们进行体外原代培养扩增或永生化后植入脑内 ,均能观察到其在脑内的迁移和分化现象。其分化能力主要取决于移植部位的脑内微环境 ,但这种影响作用是相对的。同时 ,体外培养环境如培养时间和细胞融合程度、维甲酸类诱导分化剂处理、NGF转导处理再移植或与嗜铬细胞 (分泌NGF)共移植等 ,也能决定神经干细胞脑内移植后向神经元方向分化的能力。神经干细胞移植为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。     

影响骨髓间充质干细胞分离效率的若干因素的研究

骨髓间充质干细胞来源有限,数量稀少,极大地限制了其在组织修复、细胞治疗等方面的应用。为了解决细胞数量限制的问题,从提高分离效率的角度对骨髓间充质干细胞的分离过程进行了研究,考察了培养基种类、初次换液时间、起始接种密度对兔骨髓间充质干细胞分离效率的影响。结果表明,α-MEM培养基较DMEM、DMEM-LG培养基更适于兔MSCs的分离;从骨髓中分离得到的单个核细胞以1×106cells／ml的密度接种,接种24h后换液在短时间内得到的MSCs数目最多。采用以上分离条件,能够获得形态均一、可稳定传代10代以上仍保持旺盛增殖能力的MSCs,并具有向骨、脂肪分化能力。