减毒沙门氏菌介导的血小板第四因子活性片段的放射保护作用研究

目的:观察减毒沙门氏菌携带的血小板第四因子活性片段PF417 70 的放射保护作用。方法:通过口服途经喂饲小鼠携带PF4活性片段的减毒沙门氏菌,在第 2次喂饲后小鼠接受 70 0cGy全身照射,然后观察PIRES2 EGFP PF417 70 在小鼠体内的表达,并观察小鼠的造血恢复情况。结果:在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、小肠、外周血及骨髓均能检测到GFP的表达和转基因的整合。与对照组比较,实验组小鼠的生存期明显延长,照射后第 7d和 1 4d骨髓有核细胞数、骨髓培养的CFU GM和HPP CFC数量明显增加 (P <0 0 5 )。结论:首次应用减毒沙门氏菌SL32 61为载体来介导PF4活性片段的生物学作用,并证实通过口服途径可以保护小鼠免受放射损伤,并促进放射损伤后小鼠的造血恢复。     

口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠的促造血重建作用

目的:探索口服携带人PF4基因的减毒沙门氏菌对大剂量化疗小鼠造血重建作用。方法:通过在大剂量化疗前／后喂服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌,检测化疗后小鼠的生存率,小鼠在不同时间外周血血常规、骨髓细胞数、骨髓中Sca-1和C-kit细胞含量、不同时间骨髓生成各系细胞的集落数等。结果:在大剂量化疗前、后均口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠生存率高于只在化疗前口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组;两组口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠存活率明显高于PBS对照组及携带空载体的减毒沙门氏菌组;口服携带PIRES2-EGFP／PF4减毒沙门氏菌组小鼠在化疗后第9~12天的外周血血小板数、骨髓细胞中Sca-1和C-kit阳性细胞含量明显比对照组高,第5天、9天、12天的骨髓细胞总数、骨髓细胞形成Mix集落数明显增加。结论:口服减毒沙门氏菌SL3261为载体的PF4基因可以保护小鼠免受损伤,并促进化疗损伤小鼠的造血恢复。     

抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库的构建及初步鉴定

目的：利用噬菌体展示技术构建抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库。方法：收集P3代培养的UC-MSCs免疫BALB/c小鼠,提取其脾细胞总RNA,RT-PCR扩增全套VH和VL基因片段,将其先后克隆入噬菌粒pSEX81中,构建成完整的噬菌体ScFv抗体库。结果:构建的噬菌体ScFv抗体库的库容为2×107cfu,ScFv插入重组率为93％,BstN1酶切图谱呈不同多样性。ScFv抗体库经3轮初步筛选后插入重组率达100％,3个克隆出现了相同的酶切图谱,并且随着筛选次数的增加,输出/输入比明显提高,这说明抗体库得到了特异性富集。结论：成功地构建了抗脐带间充质干细胞表面分子噬菌体ScFv抗体库,这为将来筛选特异性抗体和进一步用于间充质干细胞表面特异性分子研究奠定了坚实的基础。     

血小板第四因子在原核中的高效表达、分离纯化及活性测定

目的：构建重组表达质粒pET-32c/PF4,并在原核中进行表达,以探讨其对白血病细胞系（HEL）细胞增殖的作用。方法：通过PCR方法从含有PF4基因的PQE-60/PF4质粒中扩增PF4,用NcoⅠ/HindⅢ双酶切,克隆到原核表达质粒pET-32C中,使之在BL21表达,Ni-Chelating Sepharose亲和柱纯化,用细胞集落形成方法研究重组PF4对HEL的抑制作用。结果：菌株筛选后在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,重组PF4占菌体总蛋白的22%,肠激酶酶切除去端啧合部分,获得了高纯度的重组人血小板第四因子（rh-PF4),纯度为95%以上,活性实验发现重组PF4可抑制HEL细胞集落的形成,抑制率为47%,结论：原核表达质粒pET-32C可高效可溶性表达PF4,重组PF4对HEL细胞的增殖有抑制作用。     

脐血CD34-单个核细胞来源间充质干细胞研究

目的 :探讨分离培养脐血CD₃₄^- 细胞来源间充质干细胞 (MSC)及研究其生物学特征。方法 :取足月妊娠健康产妇胎儿脐血 ,分离其中单个核细胞 (MNC) ,去除CD₃₄⁺细胞 ,体外用低糖型DMEM培养基培养。观察细胞形态、测定生长曲线、利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定、细胞周期分析、体外诱导分化实验以及检测造血因子的表达情况。结果 :脐血CD₃₄^-细胞中可培养出间充质干细胞 ,可诱导向成骨和脂肪细胞分化并表达IL 6、SCF和SDF 1等造血生长因子。结论 :从足月妊娠健康产妇脐血CD₃₄^- 细胞可分离培养出间充质干细胞 ,具有与其它来源MSC类似的表型及分化潜能 ,在体外传代可保持其低分化状态并表达造血因子 ,可作为组织工程的种子细胞和具有促进造血作用     

胎儿肺组织来源间充质干细胞的分离、培养、鉴定及重编程初探

该文主要研究将进行胎儿肺部组织来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived from fetal lung,FL-MSCs）转变成为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）。首先使用酶消化法对胎儿肺部组织进行分离,然后采用常规方法进行培养并成功获得成纤维细胞样细胞。使用共聚焦技术检测获得的细胞,发现角蛋白表达呈阴性;共聚焦技术检测c-Myc、Oct4、Nanog以及Nestin四个干性相关因子,发现它们呈阳性;检测成纤维细胞样细胞的免疫表型,符合间充质干细胞的表型判断标准;然后进行诱导分化实验,发现这些细胞可以向成脂、成骨细胞分化,经过以上实验鉴定获得的成纤维细胞为FL-MSCs。使用Yamanaka四因子体系对FL-MSCs进行诱导,可以形成类似人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hES细胞）的克隆,采用核型分析、STR检测分析以及畸胎瘤形成实验初步验证获得的克隆为iPS。     

HAPO促进放射损伤小鼠的造血重建

目的 明确人促血液血管细胞生成素 (HAPO)对骨髓抑制小鼠的造血重建作用。方法 研究HAPO、G-CSF对骨髓抑制小鼠的促造血作用,以700 cGy 137Csγ射线全身照射的Balb/c小鼠为模型,观察照射后小鼠的生存率;检查血常规;计数内源性脾结节;计数骨髓细胞数;采用半固体培养基进行集落培养检测骨髓细胞的高增殖潜能;取小鼠骨髓细胞接种于96孔培养板,分别在照射前或照射后加HAPO、G-CSF培养72hr,MTT方法测定活细胞数;取小鼠骨髓细胞,分别在照射后加HAPO,培养3周后观察各组小鼠骨髓细胞的生长情况。结果 HAPO、G-CSF均可明显提高放射后的小鼠的生存率;使内源性的脾集落增加。照射后的各组小鼠外周血白细胞变化较为明显,HAPO组白细胞恢复快于PBS组,也可高于G-CSF组。各组小鼠骨髓细胞数虽然14天时G-CSF组最为明显,但32天时HAPO组骨髓细胞数超过G-CSF组,至42天时基本恢复正常;而G-CSF组在32天、42天时骨髓细胞数仍低于正常值。在7天、14天、32天时取各组小鼠骨髓细胞高增殖潜能检测试验,HAPO组生成的GEMM-CFU数均最多。在照射前与HAPO、G-CSF孵育的骨髓细胞,HAPO组活细胞数量比对照组明显增高,而G-CSF组与对照组无明显差异。骨髓细胞被照射后培养72hr时,MTT测定显示不同剂量HAPO、G-CSF均能促进放射后骨髓细胞的增殖。骨髓细胞被照射后继续培养3周,HAPO组均有造血岛生成,细胞sca-1、CD31呈阳性,周围CD31阳性的内皮细胞增多。而PBS组则未出现造血岛,基质细胞中极少有CD31阳性细胞的内皮细胞,未发现sca-1阳性细胞。结论 体内、外实验表明,人促血液血管细胞生成素HAPO对放射损伤的Balb/c小鼠有明显的促造血重建作用,提高小鼠的生存率,促进其造血干细胞的增殖与生长。     

脐血CD-34单个核细胞来源间充质干细胞研究

目的 :探讨分离培养脐血CD-3 4 细胞来源间充质干细胞 (MSC)及研究其生物学特征。方法 :取足月妊娠健康产妇胎儿脐血 ,分离其中单个核细胞 (MNC) ,去除CD 3 4 细胞 ,体外用低糖型DMEM培养基培养。观察细胞形态、测定生长曲线、利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定、细胞周期分析、体外诱导分化实验以及检测造血因子的表达情况。结果 :脐血CD-3 4 细胞中可培养出间充质干细胞 ,可诱导向成骨和脂肪细胞分化并表达IL 6、SCF和SDF 1等造血生长因子。结论 :从足月妊娠健康产妇脐血CD-3 4 细胞可分离培养出间充质干细胞 ,具有与其它来源MSC类似的表型及分化潜能 ,在体外传代可保持其低分化状态并表达造血因子 ,可作为组织工程的种子细胞和具有促进造血作用     

脐带间充质干细胞移植对慢性试验性肝损伤的治疗作用

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSC）对慢性实验性肝损伤的治疗作用并探讨其分子生物学机理。方法 50只7周龄的NOD/SCID小鼠注射四氯化碳（CCL4）制备慢性肝损伤模型后,应用随机数字表的方法随机将实验小鼠随机分成2组：模型组（25只）和UC-MSC移植组（25只）。UC-MSC移植组通过尾静脉注射移植1×106 UC-MSC,模型组注射同样体积的PBS。分别于移植后1、2、3和4周收集肝组织,应用免疫组织化学,RT-PCR和Western blot的方法分析细胞移植前后肝组织的病理生理学特征的变化。采用t检验和方差分析进行统计学分析。结果 UC-MSC移植治疗后肝组织表达人肝细胞特异性AFP,Alb,和内皮细胞特异性CD31,Flk-1。细胞移植4周后v WF标记的血管密度明显增加,同时伴有部分的肝功能改善,谷丙转氨酶（ALT）水平从（55.71±11.33）U/L减至（36.75±12.80）U/L（P〈0.05）。此外,本研究结果表明UC-MSC分泌几种重要的生长因子HGF,FGF-2,VEGF,和VEGF受体通过旁分泌的途径发挥肝组织修复的功能。结论在CCL4诱导的慢性肝损伤模型肝组织,人UC-MSC可以分化成肝细胞样细胞和内皮细胞样细胞,同时旁分泌多种细胞生长因子修复损伤的肝细胞,并伴有肝功能的改善。认为UCMSC移植或许成为将来肝脏损伤疾病一个重要的治疗选择。     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。