微进化对阿萨希毛孢子菌与小鼠巨噬细胞RAW264.7相互作用的影响

目的研究微进化对阿萨希毛孢子菌(T.asahii)与巨噬细胞RAW264.7相互作用的影响。方法将微进化前后的T.asahii与RAW264.7细胞共培养,检测RAW264.7对两株菌的吞噬和杀伤能力以及两株菌对RAW264.7产生的细胞毒性的差异,同时分析RAW264.7自身细胞因子分泌情况的变化。结果巨噬细胞对原代菌株(TO)的吞噬能力以及杀伤率均明显高于微进化株(TEVO);TO菌株对巨噬细胞的细胞毒性要强于TEVO;当巨噬细胞与菌株按1∶3或1∶6共培养24 h时,与TO共培养的巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌量要高于TEVO组,而按1∶9共培养时TEVO组细胞因子的分泌量却高于TO组。结论微进化后的TEVO菌株与巨噬细胞的相互作用明显弱于原代株TO,这也为TEVO菌株在宿主体内长期共存提供了良好的基础。     

抑制阿萨希毛孢子菌顶体对其增殖及致病性的影响

目的探讨抑制阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)顶体(Spitzenkrper)形成后对其细胞增殖及致病性的影响。方法经不同浓度细胞松弛素D(0.5、1.0及2.0μmol/L)处理阿萨希毛孢子菌,以抑制其顶体形成,体外测定生长曲线及生长菌落变化;小鼠体内接种上述菌悬液后,统计小鼠3周内的死亡率,并取内脏进行组织培养和病理检查,统计感染率。结果经细胞松弛素D处理抑制顶体形成后,T.asahii细胞生长明显延迟8~16 h,生长菌落直径明显变小;小鼠死亡率及感染率亦出现不同程度降低,并随着药物浓度的升高,其致病性明显降低。结论抑制阿萨希毛孢子菌顶体形成后,细胞增殖明显受到抑制,且致病性也随细胞松弛素D浓度的增加而降低。提示顶体可以作为研制新型抗真菌药物的新靶点。     

皮内与腹腔接种不同来源菌株对实验性小鼠孢子丝菌病的影响

目的将不同来源的申克孢子丝菌菌株接种于免疫抑制处理后的小鼠皮内及腹腔,造成其实验性感染,观察其感染情况,研究不同菌株及不同接种途径对小鼠孢子丝菌病的影响。方法分别在小鼠皮内和腹腔注射孢子丝菌菌悬液0.1ml,约含1×107个孢子,观察3周。观察结束时处死小鼠取其血、脑、肺、肝、脾、肾、肠系膜、睾丸、腹膜进行真菌培养和组织病理检查。结果皮内和腹腔接种不同来源菌株的小鼠各器官感染率各不相同。播散株皮内接种组、固定株腹腔接种组、播散株腹腔接种组的各器官平均感染率分别为16.05%、18.89%、58.73%。播散株腹腔接种组与其他二组之间差异均有显著性,脾和睾丸是最易受累的器官。结论不同来源菌株可能毒力不同,播散型菌株具有更强的侵袭性。脾脏可能在宿主抗孢子丝菌感染中具有重要作用。     

阿萨希毛孢子菌对人外周血单核源树突状细胞表型和功能的影响

目的通过体外研究热灭活阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)孢子对健康人外周血单核源树突状细胞(dendritic cells,DCs)的表型和功能的影响,探讨DCs在T.asahii感染中可能发挥的作用。方法体外诱导培养正常人外周血DCs,与不同浓度的热灭活T.asahii孢子进行孵育,DCs与T.asahii浓度比分别为1∶1、1∶5和1∶10,RPMI-1640及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激组分别作为空白对照及阳性对照,在显微镜下观察各组DCs形态的变化;瑞氏-姬姆萨染色观察实验组DCs对T.asahii的吞噬情况并计算吞噬率;流式细胞术检测各组DCs表面共刺激分子表达情况。结果诱导孵育过程中DCs形态发生明显改变;24 h时实验组部分DCs内可观察到不止一个被吞噬的T.asahii孢子,吞噬率组间差异有统计学意义(P0.05);与空白对照组相比,实验组DCs形态发生明显改变,且表面共刺激分子CD80、CD86、CD83表达水平明显升高(P0.05),但升高水平低于LPS刺激组,差异有统计学意义(P0.05)。结论人外周血DCs吞噬热灭活的T.asahii孢子后,形态发生改变,表面分子表达水平升高,DCs进一步成熟。     

CD40L启动CD4^＋T细胞缺乏小鼠免疫反应的研究

随着HIV感染者及各类医疗措施导致的免疫受损者的增多,探讨一种适合免疫缺陷人群的预防机会感染的策略越来越受到重视。研究表明,CD4^＋T细胞是抵抗肺孢子菌等机会感染的最主要因素,但不是唯一的因素。其中CD40配体（CD40L）被认为是一种可以启动B细胞和CD8^＋T细胞反应的关键因子。为探讨CD4^＋L是否能在缺乏CD4^＋T细胞的小鼠体内启动免疫反应,本文研究了用卵白蛋白（OVA）作为模型抗原,联合应用CD40L引起的免疫反应。结果显示,同时应用OVA和CD40L,可使CD4^＋T细胞耗竭小鼠体内抗OVA IgG抗体和抗原特异性IFN明显增多,提示在CD4^＋T细胞缺乏的宿主体内,CIMOL可以启动B细胞和CD8^＋T细胞类免疫反应。该结果为抗肺孢子菌等机会性感染的免疫预防研究提供可贵的资料。     

真菌GXM生物学活性及影响因素的研究进展

葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)是新生隐球菌(C.neoformans)荚膜的主要成分,经研究发现GXM也存在于毛孢子菌中,是阿萨希毛孢子菌(T.asahii)细胞壁的重要组成成分,与真菌的毒力和致病性密切相关。本文介绍了真菌GXM的生物学活性与影响因素,为真菌的检测及临床致病性研究提供理论依据。     

菌落PCR改良技术快速鉴定阿萨希毛孢子菌的实验研究

目的探索快速鉴定阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)的简便方法。方法分别应用直接法、直接离心法、酶解法、酶解改良法4种方法进行样本预处理后的菌落PCR技术检测16株T.asahii,评价上述4种方法的敏感性和微量样本阳性率,同时与DNA常规提取法PCR结果进行比较。结果酶解改良法、直接法、常规提取法敏感性均为102CFU/m L,阳性率分别为93.75%、75%、50%;直接离心法敏感性为104CFU/m L,阳性率为43.75%;酶解法结果为阴性。结论酶解改良法是一种简便快速的PCR模板获取方法,适用于菌落PCR技术对T.asahii进行快速鉴定时的样本预处理。     

耶氏肺孢子菌与宿主免疫防御相互作用

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是由酵母样真菌耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)引起的肺炎,是免疫缺陷患者重要的致死原因。Pj一般不导致系统性感染,仅在肺部繁殖,引发严重损害肺换气功能的间质性肺炎。Pj通过主要表面糖蛋白(major surface glycoprotein,MSG)的抗原转换,逃避宿主免疫系统清除,而宿主利用dectin-1识别β-(1,3)-D-葡聚糖(beta-1,3-D-glucan,BG)、甘露糖受体识别MSG,启动天然免疫反应,继而CD4+T细胞聚集活化,调控细胞免疫和体液免疫。分泌干扰素γ的细胞毒型CD8+Tc1细胞有助于控制Pj感染,特异性抗体有助于调理加强吞噬细胞清除Pj,而聚集的中性粒细胞和非Tc1CD8+T细胞与肺损伤有关。血浆BG水平可以辅助诊断PCP,而支气管肺泡灌洗液中白介素8的水平与肺损伤及死亡预后有关。     

商陆皂苷甲基于CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞对MRL/lpr小鼠肾炎的影响

[目的]探讨商陆皂苷甲对MRL/lpr小鼠肾炎的影响和作用机制。[方法] 24只16周龄MRL/lprx小鼠随机分为对照组、商陆皂苷甲组、商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组,每组8只。实验组分别注射相应药物,1次/d,对照组给予等量生理盐水,持续4 w。给药结束后,检测血肌酐、尿蛋白/肌酐值水平;HE染色、Masson+PASM染色观察肾脏病理表现;计算AI指数、脾脏指数;检测CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞含量,IL-17、IL-35水平;分析CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞与IL-17、IL-35的相关性。[结果]与对照组比较,实验组尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度含量降低(P<0.05),其中商陆皂苷甲组尿蛋白/肌酐值、血肌酐浓度含量低于商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组(P<0.05);实验组肾脏损伤情况优于对照组,其中商陆皂苷甲组优于商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组;实验组脾脏指数、AI评分低于对照组(P<0.05),其中商陆皂苷甲组脾脏指数、AI评分低于商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组(P<0.05);实验组IL-17较对照组下降,CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞含量、IL-35值较对照组升高(P<0.05),其中商陆皂苷甲组IL-17值低于商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组(P<0.05),CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞含量、IL-35值高于商陆皂苷甲+IL-12p35抗体组(P<0.05);IL-35上调、IL-17下调与CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞变化相关(P<0.05)。[结论]商陆皂苷甲降低MRL/lprx小鼠肾脏炎症反应,其机制可能与促进CD19^(+)IL-35^(+)Breg细胞增殖有关。     

NF-κB启动的炎症反应在小鼠侵袭性肺曲霉病肺损伤中的作用

为了探讨NF-κB启动的炎症反应在小鼠侵袭性肺曲霉病肺损伤中的作用,将小鼠分3组:正常组、正常 烟曲霉菌接种组、IPA模型组,小鼠鼻吸入烟曲霉菌第4天处死,取肺组织,肺组织切片经HE染色观察病理损伤;比色法测定肺组织MPO活性;免疫组化法评价肺组织NF-κBp65蛋白的活化:RT-PCR法检测肺组织TNF-α、IFN-γ和β-tublin mRNA的表达. 结果显示,正常健康组小鼠肺组织结构正常,未见炎症发生;正常 烟曲霉菌接种组小鼠肺组织有炎症细胞浸润,未见孢子萌芽;IPA模型组小鼠的肺组织病理损伤严重,可见炎症细胞浸润,孢子萌芽生成菌丝.正常 烟曲霉菌接种组和IPA模型组小鼠肺组织的TNF-α和IFN-γ mRNA的相对表达水平、NF-κB p65免疫组化评分和MPO活性均高于正常组小鼠(P<0.05):并且IPA模型组小鼠肺组织NF-κB p65免疫组化评分值和MPO活性均高于正常 烟曲霉菌接种组(P<0.05).结果提示,烟曲霉菌感染可激活小鼠肺组织NF-κB介导的炎症信号通路,诱导下游TNF-α和IFN-γ的表达,募集大量的中性粒细胞于感染组织,是导致IPA小鼠肺组织严重病理损伤的因素之一.     

肺炎链球菌感染早期IFN-β通过调节巨噬细胞炎症反应保护宿主

该文旨在探讨干扰素-β(interferon-β,IFN-β)在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)感染早期对宿主炎症免疫的影响。使用外源重组IFN-β蛋白(recombinant IFN-β,rIFN-β)预处理WT小鼠及其腹腔渗出巨噬细胞(peritoneal exudate macrophages,PEMs),以培养基处理组作为对照。同时应用内源干扰素α/β受体(interferonα/βreceptor,IFNAR)缺陷的小鼠以及PEMs,以WT组为对照。各组分别暴露于D39菌株后,通过RT-PCR和ELISA检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平,并通过小鼠肺切片HE染色和肺干/湿重比评估其肺部炎症浸润和组织损伤,以分析IFN-β对宿主炎症反应的影响;为分析细菌清除率,对小鼠巨噬细胞系RAW264.7行吞噬实验、计数小鼠肺部细菌载量,最后通过小鼠生存率分析确认IFN-β对宿主抵抗S.pn的影响。结果表明,IFN-β抑制D39诱导的IL-1β和TNF-α的过度表达。与NC组比,rIFN-β预处理提高RAW264.7细胞对S.pn的吞噬能力(P<0.001),降低感染小鼠的肺部细菌负荷(P<0.01)和肺损伤评分(P<0.05)。而IFNAR–/–感染小鼠肺部菌载量相较于WT小鼠显著升高(P<0.001),持续更高水平的局部炎症反应导致其肺组织损伤加重且在9天内死亡率明显增加(P<0.05)。但各组小鼠体质量、肺干/湿重比和脾指数值差异无显著性(P>0.05)。可见,在S.pn感染早期,IFN-β通过调节巨噬细胞中促炎细胞因子的表达而维持适度的局部炎症反应,有助于宿主清除细菌,防止局部感染进展为致死性感染。     

免疫抑制沙鼠源肺孢子菌的分类地位

肺孢子菌能够感染多种哺乳动物的肺脏, 并在免疫受抑制的个体引起肺孢子菌肺炎. 研究表明, 肺孢子菌分离株在系统进化树上分为两大枝, 二者所含菌株分别来源于灵长类和啮齿类. 基于宿主特异性以及DNA序列和形态学差异, 每一分枝内的菌株又可分为不同的种. 本研究采用地塞米松免疫抑制法, 导致沙鼠(28/35)肺组织感染. 对18S, 5.8S rRNA和rRNA内转录间隔区基因序列, 以及线粒体核糖体大亚基基因的部分序列分析表明, 本实验沙鼠源肺孢子菌与啮齿类动物来源的同属一枝, 但明显区别于其他啮齿类动物来源的菌株, 应考虑是一个独立的菌种.     

两性霉素B和伏立康唑对临床真菌的体外抗菌活性分析

目的比较两性霉素B和伏立康唑对临床真菌的体外抗菌活性。方法用两性霉素B和伏立康唑的E-test条对分离自临床标本的116株真菌进行体外药敏试验,其中热带念珠菌15株,光滑念珠菌14株,近平滑念珠菌11株,克柔念珠菌6株,新生隐球菌8株,阿萨希毛孢子菌9株,烟曲霉29株,黄曲霉15株,黑曲霉1株,镰刀菌属7株,根霉属1株,以ATCC22019光滑念珠菌为质控菌株。结果两性霉素B对阿萨希毛孢子菌、镰刀菌、黄曲霉的MIC90均为64μg/ml,对其余受试菌株的MIC90均≤1μg/ml,伏立康唑对镰刀菌的MIC90为64μg/ml,对大部分受试菌株的MIC90均≤2μg/ml。结论除对某些真菌可能无效外,两性霉素B和伏立康唑可能适用于治疗大多数的真菌感染。     

口服卡介菌诱导免疫耐受的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞机制研究

目的：研究口服卡介菌诱导免疫耐受对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的影响。方法：采用口服MPB制备EAE大鼠模型,随机分为BCG组（0.5mg/kg）和EAE模型组（PBS）,每组各15只,连续经口灌服给药14d,同时选取15只健康大鼠作为对照组。分别于免疫后15d、27d流式细胞术检测外周血、胸腺及脾脏中CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞百分率,ELISA检测血清IL-6、TGF-β、IgE、IgG含量。结果：与EAE模型组相比,免疫后BCG组大鼠外周血、胸腺及脾脏中CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞百分率增加,血清IL-6、TGF-β含量上升,血清IgE、IgG抗体水平下降。结论：口服BCG通过上调淋巴器官中CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞比例,抑制效应性T细胞活性,发挥免疫耐受作用。     

铜绿假单胞菌脂多糖对阿萨希毛孢子菌生物膜形成的影响

目的研究铜绿假单胞菌脂多糖(LPS)对阿萨希毛孢子菌生物膜形成的影响。方法将不同浓度(100~0.1μg/mL)铜绿假单胞菌脂多糖与阿萨希毛孢子菌共培养后,利用倒置显微镜观察生物膜的形态学变化,并利用甲基四氮盐(XTT)减低法检测不同时间点生物膜生成量的变化。结果与生长对照组相比,实验组铜绿假单胞菌LPS对阿萨希毛孢子菌生物膜的生成具有菌株差异性和LPS浓度依赖性。其中,黏附阶段(2h),各浓度组铜绿假单胞菌LPS对生物膜形成的影响没有统计学差异。生物膜形成阶段(24h),与生长对照比,100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL的铜绿假单胞菌LPS对阿萨希毛孢子菌的生物膜形成的抑制作用均有统计学意义作用。而在生物膜成熟阶段(48h),只有100μg/mL的铜绿假单胞菌LPS对阿萨希毛孢子菌的生物膜形成的抑制作用具有统计学意义。倒置显微镜下,实验组菌丝形成明显受到抑制,以孢子相为主。结论铜绿假单胞菌脂多糖可以通过抑制阿萨希毛孢子菌菌丝的形成来减少生物膜的形成,并且抑制作用具有时间和浓度依赖性,以24h时,100μg/mL作用最为显著。     

SakA对马尔尼菲篮状菌药物应激及致病力的影响

目的探讨SakA对马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,TM)致病力及药物应激的影响。方法构建SakA敲除株(ΔsakA),观察孢子与巨噬细胞共培养;比较野生株及ΔsakA在药物压力下的生长状况;比较野生株和ΔsakA分别感染小鼠的死亡率、菌载量。结果被巨噬细胞吞噬24h后,野生株在胞内可见腊肠样酵母细胞,而ΔsakA以孢子形态存在。ΔsakA共培养裂解物形成的菌落数少于野生株。与野生株比较,ΔsakA对棘白霉素类药物更敏感。ΔsakA感染小鼠死亡率、菌载量较野生株明显降低。结论 SakA与TM酵母相对棘白霉素不敏感相关,在其致病过程中发挥重要作用。     

肺孢子菌肺炎小鼠模型建立及免疫学评价

目的 构建肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP)小鼠模型并进行免疫学评价。方法 采用重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠气管滴注肺孢子菌构建PCP模型,通过实时荧光定量PCR及肺组织六胺银染色进行病原学鉴定,通过苏木素-伊红染色评估肺组织损伤程度,通过免疫荧光染色和流式细胞术进行免疫学评价。结果 模型组小鼠感染6周后,肺组织肺孢子菌rRNA拷贝数显著高于假手术组,六胺银染色可见肺孢子菌滋养体和包囊,肺组织肺泡壁增厚,肺间质增宽,大量Gr-1⁺中性粒细胞CD68⁺巨噬细胞浸润,中性粒细胞活化标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和巨噬细胞活化标志物一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)活化水平显著升高,肺内及肺泡灌洗液的中性粒细胞和单核细胞数量及比例显著高于对照组和假手术组。结论 采用SCID小鼠进行气管滴注肺孢子菌能构建稳定的PCP小鼠模型,该模型表现出与临床相似的免疫学特...     

假想的脂蛋白连接酶对肺炎链球菌毒力的影响

【目的】探索假想脂蛋白连接酶(putative lipoate-protein ligase,LPL)对肺炎链球菌毒力的影响。【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)的方法失活lpl基因,通过PCR、测序鉴定缺陷菌株,采用细胞实验比较缺陷菌和野生菌对宿主细胞的粘附能力,并通过动物实验观察lpl基因缺陷后菌株毒力的变化。【结果】小鼠毒力实验表明野生菌株和缺陷株半数致死时间均为12h,两者比较无统计学差异;缺陷菌在对宿主细胞的粘附能力明显高于野生菌株(P0.01);体外荚膜染色实验表明,野生菌和缺陷菌均有荚膜。【结论】实验结果提示lpl基因对细菌粘附宿主细胞有抑制作用,但不影响其腹腔感染小鼠的能力。     

荷瘤小鼠脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞数量的分析研究

目的分析荷瘤小鼠与正常小鼠脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞(Tim-3~+/PD-1~+ CD8~+T细胞)的数量比例,预测肿瘤患者功能紊乱型CD8~+T细胞的情况,为改善肿瘤的免疫治疗提供参考。方法设置荷瘤小鼠组与正常小鼠组,每组各3只,分别从两组小鼠脾脏中提取分离获得CD8~+T细胞,用FITC标记的PD-1抗体、PE标记的Tim-3抗体与CD8~+T细胞共孵育,孵育后经流式细胞术检测获得数据,并分析结果。结果正常小鼠组脾脏CD8~+T细胞占脾脏T淋巴细胞总数百分比为7.7%,荷瘤小鼠组脾脏CD8~+T细胞占脾脏T淋巴细胞总数百分比为1.2%,两组的CD8~+T细胞数量有明显差异性(χ~2=0.299,P=0.02);正常小鼠组脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞占CD8~+T细胞总数的百分比为1.17%,荷瘤小鼠组脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞占CD8~+T细胞总数的百分比为1.17%,两组数据差异无统计学意义(χ~2=0.00,P=1.00)。结论荷瘤小鼠与正常小鼠脾脏组织中功能紊乱型CD8~+T细胞的数目无明显差异。     

(1,3)-β-D-葡聚糖在诊断深部真菌感染中的意义

探讨(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)检测对于诊断深部真菌感染的临床意义。收集2009年同时进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测和真菌培养的住院患者的临床资料。分析不同科室送检真菌抗原情况,重症医学科的(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性者真菌菌种分布情况以及(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性情况。同时送检(1,3)-β-D-葡聚糖和真菌培养共275例,重症医学科送检最多,共178例:重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性36例(阳性率20.22%);重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性同时真菌培养阳性者25例,其中白假丝酵母菌10例,热带假丝酵母菌7例,光滑假丝酵母菌4例,阿萨希毛孢子菌2例,克柔假丝酵母菌1例,烟曲霉1例。11例(1,3)-β-D-葡聚糖假阳性,9例存在细菌菌血症。重症医学科等科室应加强真菌感染监测。深部真菌感染中,假丝酵母菌属感染最多见。细菌菌血症可能造成(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性。