痢疾志贺菌A1型IroN, ShuA单、双突变体的构建及功能分析

本研究构建了痢疾志贺菌A1型SD51197株IroN及ShuA基因缺失及插入的单、双基因突变体MTS-1、MTS-2、MTS。对各突变体在培养基、细胞水平进行了功能检测,并利用SD51197全基因组芯片对各突变株进行了铁丰富和铁限制条件下的表达谱分析。结果显示,在添加铁螯合剂DIP条件下,各突变株生长水平都明显低于野生株,补加铁离子可以使突变株回复到正常生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖和胞间扩散能力实验中,各突变株的生长状态都没有明显变化,但在HeLa细胞侵袭过程中添加DIP,MTS-1、MTS-2、MTS的胞内存活增殖能力与野生株相比分别下降了23.4%、25.2%、43.6%。铁限制条件下的表达谱结果表明,各突变株对缺铁的变化比野生株更敏感,多个基因的表达发生改变,上调基因主要涉及转录、辅酶代谢、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因主要包括能量代谢和碳水化合物代谢以及功能未分类的基因;已知的转铁相关基因普遍上调。此结果表明运铁相关基因IroN、ShuA可能影响着志贺氏菌的生长和毒力。     

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。     

志贺菌福氏2a毒力大质粒DNA全序列的测定与基因分析

对志贺菌福氏2a 301株的毒力大质粒pCP301的DNA全序列进行了测定, 并进行了结构分析. 结果表明, pCP301 DNA全序列由221618个碱基对组成, 基因分析共确定了272个开放读码框架(ORF), 经过与基因数据库比较, 其中194个ORF与已知基因或编码产物具有高同源性, 61个ORF同源性较低, 其余17个为新确定的未知功能的ORF. pCP301中的基因主要包括: (ⅰ) 与细菌毒力有关的ipa-mxi-spa, osp和iph基因; (ⅱ) 与调控有关的vir基因; (ⅲ) 与质粒的维持、稳定和DNA代谢有关的mvp, stb, rep和par等基因; (ⅳ) 转座酶编码基因. pCP301中的插入序列总长68 kb, 占全序列的 30%, 提示pCP301在细菌生长与进化过程中发生了多次基因重排. 研究结果对揭示志贺菌的致病机理及大质粒的遗传与进化有重要意义.     

福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因突变体的构建

目的：构建福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体,以进行后续ArgT功能研究。方法：根据福氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用λ-Red重组系统对argT基因进行缺失,并经PCR验证;采用定点突变的方法构建ArgT非降解株,并经SDS-PAGE验证;对野生株、argT缺失突变株和ArgT非降解突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：构建了2457T的argT缺失突变株和ArgT非降解突变株;2种突变株初始生长均较慢,但最终和野生株状态一致;2种突变株利用甘露醇的能力都比野生株强,而利用葡萄糖的能力降低。结论：获得了福氏2a志贺氏菌2457T株argT基因缺失突变体和ArgT蛋白非降解突变体。     

白念珠菌高铁还原酶FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.     

白念珠菌高铁还原酶职FRP1基因的功能

白念珠菌((Candida albicans)获得铁的能力影响细胞的生长和毒力,高铁还原酶是白念珠菌高亲和铁吸收系统的重要组成部分.[目的]构建高铁还原酶FRP1(Ferric reductase protein)基因缺失突变株,对FRP1基因功能进行初步研究.[方法]使用Northem杂交的方法分析FRP1基因在缺铁和富铁条件下的表达.利用PCR介导的基因敲除技术构建frp1缺失突变株,并且对野生型和缺失突变株在细胞高铁还原酶活性以及缺铁条件下的生长情况进行比较分析.[结果]缺铁条件可以诱导FRP1基因的表达.frp1缺失突变株不能在铁缺陷的固体培养基上生长.[结论]FRP1蛋白可能是白念珠菌在缺铁条件下起主要作用的高铁还原酶.     

密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

密度感应系统调节细菌应答反应的发生,这些应答反应与细胞密度有关。通过对比大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella spp.)的序列发现,志贺菌属密度感应系统操纵子普遍存在丢失或突变。为研究其密度感应系统的功能,文章利用哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170作为指示菌,检测弗氏志贺菌(Shigella flexneri)密度感应系统信号分子AI-2,证明其可以分泌有活性的AI-2;其次,采用Golden Gate克隆法将大肠杆菌MG1655的密度感应系统基因克隆至弗氏志贺菌301中,获得密度感应系统回复株301。通过菌落计数表明,在混合培养条件下,密度感应系统基因回复株301比野生株301存在生长优势;通过双向电泳初步比较分析表明,密度感应系统基因可以在志贺菌中表达,并鉴定到了其他一些与应激反应相关的差异表达蛋白, 如Hsp60、GroEL、SodB。     

志贺菌福氏2a入侵上皮细胞诱导表达的毒力相关基因筛选与鉴定

采用体内表达技术的研究策略筛选了志贺菌福氏2a侵入上皮细胞后诱导表达的基因, 用基因突变技术进一步对它们的功能进行了鉴定. 结果共筛选到13个胞内诱导基因, 其中2个DNA甲基化相关基因、1个代谢相关基因、1个转录调控基因、3个插入成分、3个反义转录体、3个未知功能基因. 突变体分析发现, 3-甲基糖基化酶Ⅱ, 柠檬酸裂合酶的编码基因和未知功能基因wcaJ的突变体在细胞和动物感染实验中都显示其存活增殖能力的降低, 表明这些基因可能参与了志贺菌在上皮细胞内的存活和增殖. 同时也表明, 这种在上皮细胞内的存活增殖能力是志贺菌主要的毒力体现之一. 但是, 未知功能基因yaiC的突变体只在动物体内表现出明显的毒力缺陷, 在上皮细胞内没有明显的增殖缺陷, 这表明yaiC基因参与其他毒力作用机制. 研究结果对深入认识志贺菌的致病机理有重要意义.     

痢疾基因工程三价菌苗候选株的构建

通过DNA体内外同源重组, 用霍乱毒素B亚单位基因(ctxB)完全取代了福氏志贺氏2a T32株染色体上的asd基因, 获得了稳定表达CtxB的DAP依赖株FWL01. 随后, 用T32株的asd基因标记志贺氏宋内S7株的Ⅰ相大质粒, 并将其诱动至FWL01, 构成三价菌苗候选株FSW01. 在该菌苗候选株中, 表达宋内Ⅰ相O抗原的大质粒与宿主菌是平衡致死的. 因此, 该候选株在没有任何抗生素存在情况下, 能稳定地表达福氏 2a, 宋内O抗原和CtxB. 豚鼠眼角膜试验和HeLa细胞侵袭试验证明FSW01无毒, 家兔免疫试验证实了其有很好的免疫原性. 小鼠和猴体免疫保护试验显示该候选株对相应的有毒株攻击具有很好的保护效果.     

痢疾杆菌福氏2a sf301DsbA/virG双突变减毒活候选疫苗构建和初步鉴定

为预防细菌性痢疾的爆发和流行,构建志贺氏福氏2a减毒活疫苗。 选用中国痢疾杆菌主要流行株sf301为受体菌,通过基因重组交换技术,突变细菌 DsbA和virG基因, 并以Serney试验和HeLa细胞侵袭实验鉴定突变菌株sf301：△virG：DsbA33G毒力和侵袭力,采用豚鼠结膜囊接种免疫动物,检测突变菌株免疫原性,了解候选疫苗对免疫动物的保护能力。 与野生亲本比较sf301: △virG：DsbA33G已完全丧失毒力,但保留了一定的侵袭力。与未接受免疫的对照组相比,通过粘膜途径免疫的豚鼠,无论是单次免疫,还是双次免疫策略都可以诱发血清和胃肠道粘膜部位产生特异性抗sf301 LPS IgG和IgA;面部、胃肠道引流淋巴结和脾脏中IgG和IgA 抗体分泌细胞（Antibody secret cells ASCs）数目显著性增高;两种免疫方案都可给免疫动物提供100%抵抗野生亲本毒株攻击的能力。初步动物实验结果提示构建的福氏2a活疫苗sf301: △virG：DsbA33G是一种潜在的候选痢疾疫苗。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变株的构建

目的:构建弗氏2a志贺氏菌2457T株yciD基因缺失突变体,以研究yciD基因的功能。方法:根据弗氏2a志贺氏菌2457T株基因组全序列,采用Red重组系统对yciD基因进行缺失,并经PCR和SDS-PAGE证实;对野生株和突变株的生长状态及生化反应进行比较研究。结果:构建了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株2457TΔyciD,该突变株外膜蛋白样品中缺失了一条相对分子质量与从yciD基因推导的蛋白相当(约22000)的蛋白带。该突变株比野生株生长快,利用葡萄糖和甘露醇的能力也比野生株大为增强。结论:获得了弗氏2a志贺氏菌2457T株的yciD基因缺失突变株。     

两株刚果红结合突变型志贺菌大质粒全基因组比较研究

对福氏志贺菌(Shigella flexneri)5型及志贺氏志贺菌(Shigella dysenteriae)1型两株与刚果红结合突变菌株的大质粒pSF5及pSD1进行了全基因组测序及分析. pSF5全长136694 bp, 包含165个ORFs, 其中133个功能明确, 32个功能未知. pSD1全长182726 bp, 共有224个ORFs, 其中181个功能明确, 43个功能未知. pSF5中IS序列为53787 bp, pSD1中为49616 bp, 分别占整个基因组的39.3%, 27.2%. 二者中共有22种不同类型的IS出现, 其中ISEc8, ISSbo6在志贺菌大质粒中为首次报道. 与pCP301相比, pSF5和pSD1都发生了大范围基因缺失, 并在多处发生基因片段倒置等现象. pSF5中除与侵袭相关ipa-mxi-spa基因岛完全缺失外, 与O-抗原生物合成密切相关的shf-rfbU-msbB基因也部分缺失, 而在pSD1中上述基因则完整存在, 但pSD1中与侵袭基因表达调控相关的virF基因缺失. 结果表明, 在pSF5和pSD1中与侵袭相关的调控因子及侵袭基因的缺失是导致刚果红结合突变的原因之一, 但是否是唯一的原因还需进一步的验证.     

志贺菌对HeLa细胞侵袭力的研究

通过使用噬斑形成试验、透射电镜及检测志贺菌蛋白表达等方法,研究志贺菌对Hela细胞的侵袭能力。研究发现:37℃培养条件下,胞质内出现成堆的志贺菌;30℃培养条件下,细菌主要分布在细胞外。SDS-PAGE显示,与30℃培养条件相比,在37℃培养下,志贺菌表达蛋白质的种类和数量明显增加。噬斑形成发现,12株福氏志贺菌强毒株,有9株噬斑数>1000个／ml,而2株弱毒株噬斑数则在50个／ml以下。透射电镜证实了志贺菌对细胞的黏附、侵入和释放过程。结果表明:志贺菌对细胞的侵袭能力受温度的影响;不同志贺菌流行株对细胞的侵袭力存在着差异:实验也显示,应用HeLa细胞研究志贺菌侵袭力是一种简便易行且价廉的方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达

对杆状病毒BactoBac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽S转移酶（glutathioneStransferase, GST）基因,构建GST融合表达转座质粒pFGST。通过转座和转染Sf9细胞,证实该系统能高水平表达GST。采用PCR方法从pMTgp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株ORF5基因,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中,使之与GST融合,构建的重组转座质粒pFGST53转染DH10Bac,提取大分子Bacmid DNA,转染Sf9细胞,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53。rvGST53感染Sf9细胞,SDSPAGE和Western印迹分析表明：与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达,表达产物分子量为45kD,能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应。将表达产物免疫小白鼠,经间接免疫荧光检测,免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC145细胞呈较强的荧光着色,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性。     

Mcc在脱色希瓦氏菌S12电极呼吸中的作用

【目的】研究脱色希瓦氏菌S12周质空间c型细胞色素Mcc的功能,进一步探索和补充微生物胞外电子传递过程的机制。【方法】借助自杀质粒敲除mcc基因,通过细胞浓度测定和激光共聚焦显微镜比较分析突变株和野生株之间的浮游细胞和生物膜的生长情况,并比较分析二者在微生物燃料电池电极还原、铁还原和胞外偶氮染料还原过程中的功能。【结果】Mcc缺失对铁还原和偶氮还原没有影响,但却造成电极呼吸活性下降34.1%;与野生株相比,mcc突变株的好氧生长和厌氧浮游细胞生长无明显影响,但却显著抑制了电极表面生物膜的形成。【结论】Mcc是希瓦氏菌S12电极呼吸过程中周质空间电子传递的重要组分之一,缺失会显著抑制其电极呼吸效率以及生物膜的形成。     

炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体的构建

目的：构建炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体,以进行后续SLP的功能研究,为炭疽芽孢杆菌重要基因功能的研究建立技术平台。方法：利用PCR技术,分别扩增得到目的基因的上游同源臂（slp-F）和下游同源臂（slp-R）,将抗性基因（S）和上、下游同源臂先后连入穿梭质粒pKSV7,构建打靶载体pKSV7-FSR,经去甲基化后,电转化入炭疽芽胞杆菌A16R,通过同源重组敲除slp基因,并通过DNA测序和Western blot实验验证;对野生株和突变株37℃时的生长曲线及生化反应进行比较研究。结果：分别从DNA水平和蛋白质水平证实slp基因被成功敲除;突变株对数期生长较快,衰退较慢,与野生株的生化反应差异不明显。结论：获得了炭疽芽胞杆菌假想S-层蛋白SLP缺失突变体。     

金属还原酶FreB2对烟曲霉铁吸收及氧化压力应答的影响

利用构建的烟曲霉金属还原酶基因(AFUA-1G00350,Fre B2)缺失突变株,对烟曲霉金属还原酶基因Fre B2功能进行初步研究,为揭示该基因与烟曲霉的致病关系提供依据。比较野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时高铁还原酶的活性,绘制不同时间野生株和基因缺失突变株在AMM和无铁AMM液体培养基中生长时高铁还原酶活性曲线。利用Real-Time PCR方法分析Sre A、Sid A、Fet C、Ftr A和Fre B这些与铁的吸收相关基因的mRNA的表达量变化。测定野生株和基因缺失突变株对氧化压力的敏感性及胞内活性氧物质含量。不论在AMM液体培养基中还是在无铁AMM液体培养基中培养时,突变株高铁还原酶的活性都明显高于野生株高铁还原酶活性。与野生株相比培养60 h时,突变株Sre A、Sid A、Fet C、Ftr A和Fre B这些与铁的吸收相关基因的表达量出现明显上调。氧化压力敏感性实验显示,基因缺失突变株对H2O2的敏感性显著增强,同时胞内活性氧物质含量明显增多。金属还原酶基因Fre B2在烟曲霉铁吸收及氧化压力应答过程中发挥作用;烟曲霉与铁吸收相关基因之间存在功能互补效应。     

志贺菌毒力大质粒大片段敲除方法的建立

目的:构建志贺菌毒力大质粒大片段缺失突变体库。方法:首先利用λ-Red重组系统构建弗氏2a志贺菌301株毒力大质粒特定位点缺失株,再在距离此位点20 kb处缺失另一突变位点,最后根据重组酶识别远端FRT位点的特性,将两个远端FRT位点之间的DNA序列全部缺失。结果:敲除了毒力大质粒24 kb的DNA序列。结论:利用λ-Red重组系统及FLP-FRT位点特异性识别重组系统可以对志贺菌毒力大质粒逐步进行大片段的敲除,构建大质粒大片段缺失突变体库。     

应用蛋白质组学方法完善福氏志贺菌基因组注释的研究

常规的应用计算机软件注释基因存在缺陷,目前对基因组的准确注释依然是一项富有挑战性的任务本研究旨在应用蛋白质基因组学(proteogenomics)方法完善福氏志贺菌的基因组注释。提取福氏2a志贺菌301株(Sf2a301)的全菌蛋白,胰蛋白酶水解的肤混合物经二维液相色谱分离、在线ESI串联质谱分析,质谱数据检索Sf2a301的6个读码框数据库,鉴定结果进一步经过生物信息学分析和实验验证。本研究共验证了729个Sf2a301已注释基因的蛋白编码产物,鉴定蛋白在分子量、等电点和疏水性等理化性质方面的分布与Sf2a301基因组已注释蛋白的趋势一致。共发现了6个未注释的新基因,新基因得到了RT-PCR在转录水平上的进一步验证。蛋白质基因组学能够有效的完善志贺菌的基因组注释,不仅验证了已注释基因,而且能够发现新的基因补充其原有基因组注释库,这种策略有望被推广到其他经过测序的生物体基因组注释工作中。     

蓝细菌ORF469的分子克隆和缺失突变工程株的构建

PCR扩增了蓝细菌Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469(编码469个氨基酸的开放阅读框),进一步以pUC118为载体将其克隆到E．Coli中,构建了pOQ2质粒。通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因取代部分克隆化ORF469片段,又构建丁缺失ORF469片段(保留部分上游和下游序列)的pOQ22质粒。用pOQ22质粒转化Synechocystis sp．PCC 6803野生株细胞,获ORF489缺失突变工程株,它在红霉素抗性培养基上生长正常。对缺失突变工程株DNA的PCR和Southern blot分析证明,Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469已被删除。色素测定结果揭示Synechocystis sp．PCC 6803中ORF469表达产物控制细胞内不依赖光的叶绿素生物合成。