齐墩果酸抑制肿瘤坏死因子-α诱导的成纤维细胞样滑膜细胞炎症因子表达及其机制研究

探讨齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导成纤维细胞样滑膜细胞的炎症因子表达的影响及其机制。首先复苏培养人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS),通过RT-PCR检测细胞IL-6及IL-1βmRNA表达,采用Western blot方法检测p38MAPK及NF-κB蛋白表达变化,通过ELISA法检测细胞上清液中IL-6及IL-1β浓度。与对照组比较,TNF-α明显诱导FLS细胞IL-6及IL-1βmRNA的表达及上清液中IL-6及IL-1β的分泌(P0.05),同时磷酸化p38蛋白和核NF-κB明显增加(P0.05),且p38MAPK阻断剂SB203580能抑制TNF-α诱导的核NF-κB增加。OA呈浓度依赖性抑制TNF-α诱导的FLS细胞p38蛋白磷酸化和核NF-κB增加(P0.05)。且OA、p38MAPK通路抑制剂SB203580或NF-κB阻断剂BAY 11-7082均能抑制TNF-α诱导的IL-6及IL-1β分泌增加(P0.05)。综上所述,OA能抑制TNF-α诱导的FLS细胞炎症因子IL-6及IL-1β的产生,其机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路有关。     

布地奈德对A549细胞胸腺基质淋巴细胞生成素表达作用的研究

目的:观察细胞因子刺激气道上皮细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)表达是否涉及核因子κB(NF-κB),并探讨糖皮质激素布地奈德对气道上皮细胞TSLP表达和NF-κB核转位的影响.方法:A549细胞与细胞因子白介素1β(IL-1β)、白介素4(IL-4)和布地奈德共同孵育,以不加任何细胞因子或布地奈德培养的A549细胞为对照组,采用RT-PCR方法测定TSLP mRNA表达,细胞免疫荧光方法检测TSLP和NF-κB的表达情况.结果:与对照组比较,IL-1β(10 ng/ml)及IL-4(10 ng/ml)显著刺激A549细胞TSLP mRNA表达,且NF-κB(p65)核转住增加(均P＜0.05).布地奈德干预后TSLP mRNA的表达和NF-κB(p65)的核转位显著减少(P＜0.05).结论:细胞因子促进气道上皮细胞诱导性表达TSLP与NF-κB激活有关,抑制TSLP表达和NF-κB激活可能是布地奈德治疗哮喘的重要机制.     

美洛昔康对Aβ诱导Alzheimer’s disease大鼠脑内炎症损伤的影响

目的：研究美洛昔康对β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的阿尔茨海默病（AD）模型大鼠脑内炎症损伤的保护作用,并探讨其抑制炎症作用的机制。方法：Aβ1-40海马注射建立AD大鼠模型。免疫组化法观察大鼠海马核因子κBp65（NF-κBp65）和星形胶质细胞（AS）胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达变化;Western-blot法测定大鼠皮层组织GFAP的表达;ELISA法检测大鼠皮层组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平变化;RT-PCR法检测大鼠海马组织白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA的表达情况。结果：美洛昔康能抑制AD大鼠海马NF-κBp65和GFAP的表达;降低大鼠皮层TNF-α的含量;抑制AD大鼠海马IL-1βmRNA的表达。结论：美洛昔康通过减少AD模型大鼠海马、皮层组织GFAP表达,抑制AS的增生,降低NF-κBp65的活性,减少炎症因子TNF-α和IL-1β的水平,减轻脑内炎症反应。     

马桑内酯对培养的大鼠海马星形胶质细胞的激活

实验研究了马桑内酯对纯化培养的大鼠海马星形胶质细胞的影响。发现：（1）免疫细胞化学染色证实马桑内酯作用2h可引起胶质细胞核内NF-кBp65的表达,8h达高峰,至24hNF-кBp65阳性胞核的百分率和平均光密度仍维持在高水平;预先用PDTC作用1h可完全抑制NF-кBp65的核表达,而TNFα单抗则可延迟NF-кBp65免疫反应阳性胞核出现的时间,阳性胞核百分率及其平均光密度也有所下降;（2）酶联免疫吸附实验发现马桑内酯可促进星形胶质细胞培养基内TNFα含量升高,PDTC可部分对抗此作用,本实验表明马桑内酯激活星形胶质细胞的作用部分是由TNFα介导的。     

七氟烷对培养的小鼠小胶质细胞炎症因子表达的影响（英文）

目的:探讨七氟烷对培养的小鼠小胶质细胞中炎症因子表达的影响。方法:取新生(2~3天)C57BL/6小鼠,分离小胶质细胞,将其随机分为4组(n=10):对照组(Control);七氟烷组(Sevoflurane);NF-κB抑制剂组(PDTC);NF-κB抑制剂+七氟烷组(PDTC+Sevoflurane)。用Drager麻醉机向Sevoflurane组PDTC+Sevoflurane组培养的小胶质细胞盒内释放21%O2,5%CO2,4.1%七氟烷的气体,用气体分析仪持续监测各组的浓度。应用Iba-1的免疫荧光染色法对小鼠小胶质细胞进行纯度鉴定。分别在于给七氟烷后2 h、4 h和6 h时采用免疫印迹分析技术检测两组小胶质细胞IL-6和TNF-α的表达水平和NF-κB的活性。PDTC+Sevoflurane组在给七氟烷前一小时给予PDTC,采用ELISA技术和免疫印迹分析技术检测各组小胶质细胞IL-6和TNF-α的浓度和NF-κB的表达。结果:免疫印迹显示七氟烷组细胞中IL-6、TNF-α水平和NF-κB的激活水平升高;PDTC降低了七氟烷作用后核内NF-κB的表达,减弱了IL-6和TNF-α水平的升高作用。结论:七氟烷可通过激活NF-κB信号通路,进一步激活培养的小鼠小胶质细胞中炎症因子的表达。     

肝组织中NF-κB、TGF-β1及其Ⅰ型受体mRNA和HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

目的探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化与增殖、核转录因子-κB(NF-κB)及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的改变及护肝片对其的影响。方法采用12.5%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)和NF-κB p65蛋白的表达,原位杂交检测TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达;并用MetaMorph图像分析系统计数-αSMA阳性细胞数,对NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量进行定量分析。结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P<0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即-αSMA阳性细胞)数量较正常组明显增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达均较正常组明显增强(P<0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达(P<0.01)。结论抑制HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白与TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一。     

顺铂对卵巢癌SKOV3细胞水通道蛋白5表达的影响及调控

应用噻唑蓝法、蛋白质印迹和RT-PCR法研究顺铂对卵巢癌SKOV3细胞水通道蛋白5(AQP5)表达的影响及其调控.结果显示顺铂浓度增加,SKOV3细胞AQP5、胞浆和胞核NF-kB p65以及胞核IkBα表达均逐渐减少(P=0.001,0.000,0.000,0.000);10 μg/ml顺铂与SKOV3细胞温育6-12 h,AQP5、胞浆和胞核NF-kB p65以及胞浆IkBα表达均明显增加达峰值,24 h后急剧下降到低值,并维持至72 h后(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.000).随着核转录因子阻断剂PDTC浓度增加、作用时间延长,AQP5表达及mRNA量均逐渐减少(P=0.000,0.000);顺铂对细胞抑制率与AQP5呈负相关(r=-0.598;P=0.009),PDTC对细胞抑制率与AQP5和mRNA呈负相关(r=-0.983,-0.905;P=0.000,0.000).AQP5表达与NF-kB p65和IkBα呈正相关(r=0.894,0.857;P=0.000,0.000).提示AQP5与SKOV3细胞生长有关,顺铂下调AQP5表达,其过程可能受NF-kB调控,为AQP5成为卵巢癌治疗的靶目标提供了一定的理论基础.     

rVvhA作用于THP-1细胞NF-κB信号通路的研究

研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对人单核细胞系（THP-1）NF-κB信号通路的影响。应用CCK-8法检测rVvhA对THP-1细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察rVvhA作用后细胞的形态学变化和细胞内NF-κB p65的核转移情况;应用流式细胞仪和Westernblot检测rVvhA作用后细胞浆内和细胞核内NF-κB p65的表达情况;ELISA检测rVvhA作用于细胞后TNF-α、IL-6表达含量的变化。试验结果显示：rVvhA能够呈时间–剂量依赖性地抑制THP-1细胞的生长,且镜下可见明显的细胞形态学变化。激光共聚焦显示0.4 HU/mL rVvhA作用6 h后,THP-1细胞内NF-κB p65的核转移现象最明显;流式细胞仪结果显示0.6 HU/mL rVvhA作用2 h后,细胞内总的NF-κB p65表达量达到高峰;Western blot检测显示0.6 HU/mL rVvhA作用4 h时细胞核内NF-κBp65蛋白含量最高;ELISA显示TNF-α的表达在rVvhA作用的适当范围内呈时间–剂量依赖性变化;IL-6在0.6 HU/mL rVvhA作用时表达量最高,随后随着浓度的增加反而下降;NF-κB抑制剂能使IL-6表达量下调。实验证明rVvhA作用于THP-1细胞后能激活NF-κB信号通路,上调TNF-α、IL-6的表达,而NF-κB抑制剂能够下调IL-6的表达。     

姜黄素通过NF-κB/miR33a通路对ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞分泌的影响及机制

为研究姜黄素对ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞炎症因子IL-6、TNF-α的分泌及相关机制。本实验分别予姜黄素、miR33a inhibitor、吡咯烷二硫代甲酸铵(ammonium pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)处理氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL)刺激的人单核细胞白血病细胞(human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)型巨噬细胞,RT-qPCR测定微型RNA33a(MicroRNA33a,miR33a)的表达,Western blot检测胞核内NF-κB p65的表达、IκBα和p-IκBα的表达,ELISA测定IL-6、TNF-α的浓度。结果显示与空白对照组相比,ox-LDL组miR33a、NF-κB p65、p-IκBα的表达及p-IκBα/IκBα的比值及IL-6、TNF-α的浓度增加(P 0. 05),IκBα的表达减少(P 0. 05);而与ox-LDL组相比,ox-LDL+姜黄素组miR33a、NF-κB p65、p-IκBα的表达及p-IκBα/IκBα的比值及IL-6、TNF-α的浓度减少(P 0. 05),IκBα的表达增加(P 0. 05)。姜黄素可能抑制ox-LDL刺激的THP-1巨噬细胞IL-6、TNF-α的分泌,其机制可能是通过下调NF-κB/miR33a信号通路。     

腺苷酸活化蛋白激酶活化对单核细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制北大核心CSCD

本研究旨在探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）活化对单核细胞与内皮细胞黏附的影响及其分子机制。用不同剂量的AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR,0~2 mmol/L）或AMPK抑制剂compound C（10 mmol/L）处理肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα,10 ng/m L）诱导的人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）,用TNFα诱导过表达活性型或显性抑制型AMPK蛋白的HAECs。用荧光染色法观察AMPK对荧光标记的单核THP-1细胞与HAECs黏附的影响。用荧光定量PCR检测血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）和细胞间黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）m RNA表达水平,用ELISA法检测二者的蛋白分泌量;用Western blot检测核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）p65的211位点赖氨酸乙酰化水平,用ELISA法检测NF-κB p65DNA结合活性,并用试剂盒检测p300乙酰转移酶活性。通过小干扰RNA抑制HAECs组蛋白乙酰转移酶p300蛋白表达后,检测TNFα对NF-κB p65 DNA结合活性、黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达及单核细胞黏附率的影响。结果显示,AICAR显著抑制TNFα诱导的单核细胞与HAECs的黏附,在HAECs中下调TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1的m RNA水平上调和蛋白分泌。AICAR的效应可以被AMPK抑制剂compound C完全阻断。转染活性型AMPKα显著抑制TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1m RNA表达和分泌,以及单核细胞-内皮细胞黏附,而转染显性抑制型AMPKα则无明显影响。RNAi干预抑制p300活性显著抑制TNFα诱导的黏附分子表达和单核-内皮细胞黏附。AMPK激活可抑制TNFα诱导的p300乙酰转移酶活性,抑制NF-κB p65的211位赖氨酸的乙酰化,降低NF-κB p65 DNA结合活性。以上结果提示,AMPK激活抑制单核细胞-内皮细胞黏附,作用机制可能与其降低p300酶活性,下调NF-κB p65转录活性密切相关。     

EWS蛋白质抑制核因子κB的转录活性

目的:研究EWS蛋白质是否参与核因子κB(NF-κB)信号通路,以及EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响。方法:在真核细胞中表达Flag-EWS,利用Western印迹检测其表达;通过双萤光素酶光报告系统,研究EWS蛋白质对NF-κB转录活性的影响及其发挥作用的分子水平。结果:Western印迹检测到相对分子质量为95×103的Flag-EWS能够在真核细胞中正确表达,过表达EWS蛋白质能够抑制TNFα、IL-1β及poly(I:C)激活的NF-κB转录活性;EWS蛋白质能够抑制由过表达HA-TRAF2或HA-p65激活的NF-κB转录活性,其抑制NF-κB转录活性发生在p65转录因子水平。结论:过表达EWS能够抑制多种刺激激活的NF-κB转录活性,这种抑制作用发生在p65转录因子水平。     

腺苷酸活化蛋白激酶活化对单核细胞-内皮细胞黏附的影响及其机制

本研究旨在探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活化对单核细胞与内皮细胞黏附的影响及其分子机制。用不同剂量的AMPK激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR,0~2 mmol/L)或AMPK抑制剂compound C(10 mmol/L)处理肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα,10 ng/m L)诱导的人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs),用TNFα诱导过表达活性型或显性抑制型AMPK蛋白的HAECs。用荧光染色法观察AMPK对荧光标记的单核THP-1细胞与HAECs黏附的影响。用荧光定量PCR检测血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)m RNA表达水平,用ELISA法检测二者的蛋白分泌量;用Western blot检测核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)p65的211位点赖氨酸乙酰化水平,用ELISA法检测NF-κB p65DNA结合活性,并用试剂盒检测p300乙酰转移酶活性。通过小干扰RNA抑制HAECs组蛋白乙酰转移酶p300蛋白表达后,检测TNFα对NF-κB p65 DNA结合活性、黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达及单核细胞黏附率的影响。结果显示,AICAR显著抑制TNFα诱导的单核细胞与HAECs的黏附,在HAECs中下调TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1的m RNA水平上调和蛋白分泌。AICAR的效应可以被AMPK抑制剂compound C完全阻断。转染活性型AMPKα显著抑制TNFα诱导的ICAM-1、VCAM-1m RNA表达和分泌,以及单核细胞-内皮细胞黏附,而转染显性抑制型AMPKα则无明显影响。RNAi干预抑制p300活性显著抑制TNFα诱导的黏附分子表达和单核-内皮细胞黏附。AMPK激活可抑制TNFα诱导的p300乙酰转移酶活性,抑制NF-κB p65的211位赖氨酸的乙酰化,降低NF-κB p65 DNA结合活性。以上结果提示,AMPK激活抑制单核细胞-内皮细胞黏附,作用机制可能与其降低p300酶活性,下调NF-κB p65转录活性密切相关。     

皮层星形胶质细胞Toll样受体4在炎症和β淀粉样蛋白形成中的作用（英文）

为了探讨星形胶质细胞在炎症和β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)形成中的作用和可能的分子机制,本研究通过LPS刺激体外培养大鼠皮层星形胶质细胞,首先采用实时PCR和Western blot方法分别检测Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,β-APP)和β-位点APP剪切酶1(β-site APP clearing enzyme 1,BACE1)m RNA及TLR4、NF-κB/P65蛋白水平,而后用免疫荧光法进一步证明NF-κB/P65的核易位,ELISA法测定培养上清中TNF-α、IL-1β和Aβ含量。结果显示,这些指标在LPS刺激后均不同程度地上调。然而,如果预先用TLR4抗体处理,与仅用LPS刺激组相比,LPS对NF-κB/P65核易位及培养上清中TNF-α、IL-1β和Aβ含量的刺激作用显著减弱或消失。结果表明,星形胶质细胞TLR4可能通过TLR4/NF-κB信号通路在炎症和Aβ的形成中发挥重要的作用。     

HepG2细胞中TNFα通过NF-κB信号通路下调GSTA1/GSTA4表达

谷胱甘肽巯基转移酶α1/α4(GSTA1/A4)是体内重要的解毒酶,可降低多种内、外源性毒性化合物的毒性．然而,胆汁淤积病人肝细胞内GSTA1/A4的表达是下调的,下调机制尚不清楚．本研究通过肿瘤坏死因子α(TNFα)处理人肝癌细胞HepG2细胞,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测GSTA1/A4、核因子κB(NF-κB)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达．发现TNFα在mRNA水平和蛋白质水平均抑制GSTA1/A4表达,且呈剂量与时间依赖关系．干扰NF-κB信号通路,可减弱TNFα对GSTA1/A4表达的抑制作用．以上结果表明,在HepG2细胞中,TNFα可通过激活NF-κB信号通路抑制GSTA1/A4表达.     

幽门螺杆菌感染激活NF-κB信号通路促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放

为了探讨幽门螺杆菌对胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放的影响,本研究将幽门螺杆菌感染SGC-7901细胞后,采用细胞计数盒(CCK-8)检测SGC-7901细胞活力,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平,Real-time PCR检测细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 m RNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB p65蛋白表达以及IκBα磷酸化水平。研究结果表明,幽门螺杆菌感染后,SGC-7901细胞活力显著增加;幽门螺杆菌感染明显上调SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 mRNA的表达;本研究还进一步发现幽门螺杆菌感染显著增加SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平;此外,幽门螺杆菌处理的SGC-7901细胞,其NF-κB p65的蛋白表达以及IκBα磷酸化水平均显著上调。本研究的结论初步表明,幽门螺杆菌感染促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子的释放,其机制可能涉及激活NF-κB信号通路。     

低氧促进脂多糖诱导小胶质细胞CXCL10表达

本文旨在观察低氧处理对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的小胶质细胞CXC趋化因子配体10 (CXC-chemokine ligand-10,CXCL10)表达的影响,并探讨其作用机制。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、低氧组、LPS组以及低氧联合LPS组,LPS组腹腔注射0.5 mg/kg LPS,低氧组放置于低压低氧舱(模拟海拔6 000 m)中,处理6 h后收集血清和海马组织样品。用ELISA法检测血清和海马组织中CXCL10的含量。用低氧(1%O2)和/或LPS (100 ng/mL)刺激小胶质细胞系BV2和原代小胶质细胞6 h,用实时定量PCR检测细胞CXCL10 mRNA表达水平,用ELISA检测细胞培养上清中CXCL10的含量,用Western blot检测核因子κB (nuclear factorκB, NF-κB)信号通路相关蛋白p65和IκBα的表达。另外,用小分子化合物PDTC阻断NF-κB信号通路后检测BV2细胞CXCL10 mRNA表达水平。结果显示,在LPS诱导的小鼠炎症模型中,低氧处理可促进LPS对小鼠血清和海马组织中CXCL...     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后免疫蛋白酶体的变化

目的观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织免疫蛋白酶体LMP2和LMP7表达及其意义。方法线栓法制作SD大鼠大脑中动脉阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,脑缺血1h再灌注72h。免疫荧光染色观察脑组织LMP2、LMP7、NF-κB、IL-1β、TNF-α表达和细胞分布。Western blot分析LMP2、LMP7、磷酸化NF-κB p65、IL-1β、TNF-α蛋白水平变化。结果 1局灶性脑缺血再灌注后上调LMP2和LPM7表达,尤其在梗死灶周边的皮层和纹状体区,与假手术组比较有显著性差异(P0.001)。2免疫荧光双标显示星形胶质细胞是LMP2主要来源细胞,而OX42阳性的小胶质细胞/巨噬细胞是LMP7主要来源细胞;而且,NF-κB、IL-1β、TNF-α与LMP2、LMP7具有一定程度的细胞共定位。3Western blot结果表明,脑缺血再灌注后NF-κB p65、IL-1β、TNF-α蛋白水平表达趋势与LMP2、LMP7变化相类似。结论局灶性脑缺血再灌注后免疫蛋白酶体LMP2和LMP7主要来源于免疫炎症相关的细胞,推测LMP2和LMP7可能参与调节缺血性脑卒中后脑神经炎症反应。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白激活核因子κB诱导人单核细胞表达前炎症细胞因子及凋亡

为了解生殖支原体(Mg)潜在的致病性及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导人单核细胞(THP-1)凋亡及表达前炎症细胞因子(CKs)的分子机制,用Mg提取的LAMPs刺激THP-1细胞,以ELISA法和RT-PCR方法分析CKs产生和其mRNA的表达。不同试实验组的细胞经AnnexinV联合PI染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。采用EMSA方法检测LAMPs处理的THP-1细胞中核转录因子kappaB(NF-κB)的激活,并分析NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocoarbamate,PDTC)对LAMPs处理的THP-1细胞产生CKs的量和其mRNA表达及细胞凋亡的影响。LAMPs能以时间和剂量依赖方式刺激THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,且能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs的mRNA及发生凋亡,PDTC能显著抑制CKs的mRNA表达水平和细胞凋亡。由于LAMPs能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs及产生细胞凋亡,因而可能是一个重要的致病因素。     

EGCG干预LMP1激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子

为阐明在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子,采用EBV阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1-LMP1细胞,利用噻唑蓝(MTT)法,观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对CNE1和CNE1-LMP1细胞生存率的影响.采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对NF-κB活性的作用.利用间接免疫荧光法,观察EGCG对NF-κB（p65）核移位的影响,再分别提取CNE1和CNE1-LMP1的胞浆及胞核蛋白,通过蛋白质印迹分析EGCG抑制NF-κB（p65）的核移位后胞浆及胞核蛋白中NF-κB（p65）的变化.采用蛋白质印迹分析EGCG对IκBα的磷酸化水平的影响.采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对EGFR启动子活性的影响,并用蛋白质印迹分析EGCG对EGFR自身磷酸化的作用.结果表明EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性,并可抑制NF-κB的活性.EGCG能抑制 NF-κB（p65）的核移位,并抑制IκBα的磷酸化.EGCG对NF-κB信号通路下游的靶基因EGFR的启动子活性及自身磷酸化都有抑制作用.由上述结果可以推断,EGCG对信号转导通路上的NF-κB、NF-κB（p65）、IκBα、EGFR多个靶点分子具有干预作用.LMP1是EB病毒编码的蛋白质,因此,EGCG抑制与病毒相联系的信号转导通路,可能是EGCG抑制与病毒相关的肿瘤的分子机制之一.     

人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。