带Myc标签的人B55α真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:构建带有Myc标签的人B55α真核表达载体,获得Myc-B55α融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出B55α编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体,Western印迹检测其表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测B55α蛋白表达水平及其对AKT磷酸化的影响;免疫共沉淀实验检测B55α与AKT是否存在相互作用。结果:双酶切和测序结果表明Myc-B55α真核表达质粒构建成功;Western印迹证实转染293T细胞后Myc-B55α融合蛋白获得表达,并可抑制AKT308的磷酸化;免疫共沉淀结果表明B55α与AKT存在相互作用。结论:构建了带Myc标签的人B55α真核表达载体,为进一步研究B55α在蛋白磷酸化修饰功能中的作用奠定了基础。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

实时定量检测NF-κB p65亚基核易位方法的建立

目的:建立可直观检测NF-κB p65亚基核易位的方法。方法:构建NF-κB p65的真核表达重组质粒p EGFP-p65,转染He La细胞,加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)后采用活细胞成像技术观察绿色荧光蛋白在He La细胞内的变化。结果:TNF-α处理后0~2 h,EGFP-p65融合蛋白主要聚集在胞浆处;TNF-α处理后4~12 h,随处理时间的延长,细胞核处的绿色荧光蛋白逐渐增强,但细胞内总荧光值基本保持稳定。结论:TNF-α可以促进EGFP-p65入核。活细胞成像技术具有操作简单、实时动态、直观、定量等优点,可用于探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)潜伏感染再激活剂的作用机制。     

核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位

目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。     

核因子-κB反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白报告系统的建立与应用

建立核因子-κB(NF-κB)反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白(d2EGFP)报告系统,作为筛选NF-κB拮抗药物及研究其相关信号转导途径的工具.分别以EGFP与d2EGFP为报告基因、neo^r为筛选基因,构建成4×κB基序为增强子、SV40为基本启动子的报告基因载体p4κB-EGFP和p4κB-d2EGFP.两载体分别与p65载体瞬时共转染HEK293细胞,通过比较不同时相点EGFP和d2EGFP的调控表达,证明p4κB-d2EGFP是较理想的NF-κB反应性绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体.将p4κB-d2EGFP稳定转染HEK293细胞,从而获得NF-κB反应性报告细胞株HEK-d2EGFP.应用NF-κB“圈套”寡核苷酸(TFD)与p65载体瞬时共转染HEK-d2EGFP,1 mg/L NF-κB和2 mg/L NF-κB TFD组对p65蛋白诱导调控表达的d2EGFP具有明显拮抗作用.结果表明,NF-κB反应性d2EGFP报告系统可特异、灵敏、动态地反映和监测NF-κB的活性变化.     

小鼠GP73蛋白真核表达质粒的构建及其对mTOR转录水平的影响

目的:构建小鼠高尔基蛋白73(m GP73)的真核表达质粒,转染HEK293T细胞株验证重组质粒活性,并检测m GP73过表达情况下对小鼠肝癌细胞中mTOR m RNA水平的影响。方法:以实验室保存的H22小鼠肝癌细胞c DNA文库为模板,采用PCR技术扩增获得m GP73序列,将其插入pc DNA3.1-Flag-vector载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用蛋白免疫印迹检测融合蛋白的表达,并用q PCR检测在GP73过表达情况下H22细胞中mTOR转录水平的变化。结果:菌液PCR、重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,蛋白免疫印迹表明m GP73蛋白在HEK293T细胞中获得表达,q PCR结果表明在m GP73过表达时mTOR的转录水平随之上升。结论:构建了pc DNA3.1-Flag-m GP73真核表达质粒,m GP73 m RNA过表达时mTOR的m RNA水平也上升,这为进一步研究m GP73在小鼠肝脏肿瘤转移过程中的作用奠定了基础。     

Sirt3过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Sirt3全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Sirt3全长基因并克隆入pc DNA3.1载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1000 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的pc DNA3.1-Sirt3质粒转入AGS和SGC-7901细胞,检测到Sirt3的m RNA和蛋白表达水平均提高。结论:构建获得Sirt3基因高效真核表达载体,将用于Sirt3的功能研究。     

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况,间接免疫荧光进行蛋白定位,通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白,hispulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示,经双酶切及测序鉴定,真核表达载体p ENTER-Csk-his正确没有突变,SDSPAGE及Western blot均可检测到大小约为51 k D的目的蛋白,说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功,间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达,通过磁珠纯化得到Csk蛋白,最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用,说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列,并构建重组p ENTER-Csk-his真核表达质粒,在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。     

类泛素蛋白FAT10对人肾上皮细胞α-烯醇酶共价修饰的初步研究

目的:构建带Flag标签的α-烯醇酶(ENO1)基因以及带Myc标签的人白细胞抗原F相关转录物10(FAT10)基因的真核表达质粒载体,鉴定ENO1和FAT10在人肾上皮细胞株HEK293中的表达,检测类泛素蛋白FAT10是否共价修饰ENO1。方法:以人宫颈癌细胞系He La的c DNA为模板进行PCR,得到eno1目的片段,与分别经EcoRⅤ和SalⅠ酶切的pFlag-CMV载体连接得到重组质粒pFlag-CMV-eno1并进行鉴定测序;以人脑组织c DNA文库为模板进行PCR,得到fat10目的片段,与分别经Eco RⅠ和XhoⅠ酶切的p CMV-Myc载体连接得到重组质粒p CMV-Myc-fat10并进行鉴定并测序。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,用Western印迹检测ENO1和FAT10蛋白的表达。将重组质粒共转染HEK293细胞,用免疫共沉淀检测FAT10对ENO1的修饰情况。结果:重组克隆载体内的eno1和fat10序列与Gen Bank报告的序列完全一致;转染HEK293细胞后,ENO1和FAT10蛋白过表达;FAT10能够共价修饰ENO1。结论:类泛素蛋白FAT10共价修饰ENO1,为肿瘤的发生、发展及迁移的研究提供了新的研究思路。     

SD大鼠维生素D受体真核过表达载体构建及功能分析

[目的]构建SD大鼠维生素D受体真核过表达载体并将其在癌细胞中表达及分析不同癌细胞VDR表达的差异性。[方法]通过基因工程方法从p UC18-rat-VDR质粒载体上通过PCR扩增得到了大鼠VDR片段全长,并构建CD513-VDR-EGFP真核超表达载体;经常规PCR、XbaⅠ和Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后提取重组质粒CD513-VDR-EGFP并进行细胞转染。利用Western Blot和q PCR方法分析蛋白和基因表达差异。[结果]荧光显微镜下可见单独转染CD513-EGFP和单独转染CD513-VDR-EGFP的293T细胞和He La细胞表达强烈的绿色荧光蛋白,并检测到蛋白及基因表达差异性的存在。[结论]成功构建重组质粒CD513-VDR-EGFP并在目的细胞中过表达(P0.01),本底水平表达的VDR在He La细胞中的表达略高于293T细胞(P0.05)。     

人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定

[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。     

人KAT7基因促进雌激素受体α表达

目的:构建带有Myc标签的赖氨酸乙酰基转移酶(KAT7)的真核表达载体,获得Myc-KAT7融合蛋白,并检测其对雌激素受体α(ERα)表达的影响。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术从中扩增出人KAT7基因的编码序列,插入p XJ-40-Myc载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,并提取总RNA采用q RT-PCR检测ERα的表达。结果:双酶切和测序结果表明Myc-KAT7真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后Western印迹鉴定表明融合蛋白得到表达,q RT-PCR表明KAT7在转录水平能够促进ERα表达。结论:构建了带Myc标签的人KAT7真核表达载体,并发现KAT7对ERα的表达具有促进作用。     

IFN-λ1在HEK293T细胞中表达纯化及活性检测

[目的]构建IFN-λ1真核表达质粒,利用人胚胎肾HEK293T细胞表达系统,获得具有良好生物学活性的IFN-λ1重组蛋白。[方法]将IFN-λ1目的基因克隆到pcDNA3.1+载体NheⅠ与XhoⅠ多克隆位点构建pcDNA3.1-IFN-λ1分泌表达质粒,并将其转染到HEK293T细胞中;采用Ni-NTA亲和层析方法分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测IFN-λ1的表达与纯度;采用qPCR、WB结合显微镜观察检测IFN-λ1的生物学活性。[结果]IFN-λ1真核表达质粒构建正确,而且能够在HEK293T细胞中分泌表达重组蛋白,分离纯化的IFN-λ1能够有效地诱导ISG15、ISG54、ISG56、OAS1、TNFα、MX1和TRAIL等凋亡相关基因的表达,激活p38促凋亡信号通路,抑制水泡性口炎病毒对BHK-21细胞的感染。[结论]成功构建了pcDNA3.1-IFN-λ1真核表达质粒,能够在HEK293T细胞中分泌表达IFN-λ1重组蛋白;分离纯化的IFN-λ1重组蛋白具有潜在的抗肿瘤和抗病毒生物学活性,为进一步研究IFN-λ1的功能和临床应用奠定了基础。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

人白细胞介素10受体α基因真核表达及与JAK1蛋白的相互作用的检测

构建含人白介素10受体α(IL-10RA)基因的真核表达质粒p ENTER-IL-10RA-His,并在HEK293中进行真核表达,并用免疫共沉淀检测JAK1与IL10RA在细胞内的相互作用。在He La细胞中提取人总RNA,通过RT-PCR获得人IL10RA的基因全长,并将其克隆至真核表达载体p ENTER-His中。经PCR扩增、双酶切、测序鉴定后,将重组质粒p ENTER-IL-10RA-His转染至HEK293细胞中。免疫印迹法检测IL-10RA蛋白在HEK293细胞中的表达。结果显示,经PCR扩增和双酶切,测序鉴定质粒克隆正确。免疫印迹可见63 k D的目的蛋白。共同转染JAK1和IL-10RA的质粒,免疫印迹可见分别为133 k D和63 k D的目的条带,免疫共沉淀鉴定了JAK1和IL-10RA的相互作用。IL-10RA基因成功构建在p ENTER-His中,并在HEK293细胞中成功表达,并成功共转染JAK1和IL-10RA质粒,免疫共沉淀检测两者的相互作用。这为JAK1和IL-10RA相互作用的机制研究奠定基础。     

PI3K/AKT/NF-κB轴调控胃癌细胞HGC-27增殖

目的:构建磷酸化AKT1(Ser473)位点突变真核表达载体,并检测PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴对胃癌细胞增殖的影响。方法:以带有pcDNA3.0-Flag标签的AKT1质粒为模板,扩增出AKT1(Ser473A)(丝氨酸突变成丙氨酸)位点突变编码序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体中,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染胃癌细胞HGC-27,通过Western印迹检测其下游基因核转录因子κB(NF-κB)在蛋白水平的变化;通过CCK-8法检测对细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明,pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达;转染胃癌细胞HGC-27后,Western印迹验证去磷酸化AKT1(Ser473A)可下调NF-κB的蛋白水平(P0.01);细胞生长曲线结果显示,转染pcDNA3.0-Flag-AKT1(Ser473A)较空载体细胞生长慢(P0.01)。结论:PI3K/AKT/NF-κB信号通路轴在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。     

Skp2过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Skp2全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Skp2全长基因并克隆入p Babe载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的p Babe-Skp2质粒转入HEK293细胞,与空质粒对照相比,Skp2的m RNA和蛋白表达水平均提高,并且p27蛋白水平降低。结论:构建获得Skp2基因高效真核表达载体,将用于Skp2的功能研究。     

ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶的真核表达及鉴定

目的：构建ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶真核表达载体,并在293T细胞（人胚肾细胞）中实现表达。方法：通过RT-PCR法扩增得到ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat1,构建重组真核表达载体pCMV－Myc－fat1,用脂质体法转染293T细胞,Western Blot检测fat1的表达,并用间接免疫荧光（IFA）确定其在293T细胞中的定位情况。结果：构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,转染293T细胞后,可检测到细胞内有fat1的表达并确定其在细胞中的位置。结论：成功构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,可检测出细胞内有fat1的表达并确定其在细胞膜和细胞质内均有表达,为进行fat1的功能研究奠定了基础。     

β-淀粉样蛋白对BV2小胶质细胞促炎作用的研究

目的探讨β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)促进BV2小胶质细胞产生炎性因子IL-1β和TNFα的作用机制。方法体外培养BV2小胶质细胞,应用Aβ1-42作用于BV2小胶质细胞,或用吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)预孵育再给予Aβ1-42刺激,实时荧光定量反转录聚合酶链反应法(RT–PCR)检测IL-1β和TNFαmRNA表达;免疫印迹法(Western blot)检测胞核中NF-κB p65及其抑制蛋白胞浆中IkBα的表达。结果 Aβ1-42作用于BV2小胶质细胞后,Westernblot显示胞浆内IkBα表达下降,胞核内NF-κB p65表达明显增加,RT-PCR测定IL-1β和TNFαmRNA的表达增加;给予NF-κB信号通路特异阻断剂PDTC后,胞浆IkBα的下降和胞核内NF-κB p65的增加均被抑制,同时IL-1β和TNFαmRNA的表达亦受到抑制,PDTC的抑制效果呈剂量依赖性。结论 Aβ可通过激活小胶质细胞NF-κB信号通路促进IL-1β和TNFα的表达。     

人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其在293T细胞中的表达

目的将人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达。方法设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1片段,分别插入真核表达载体pc DNA3.1(+)和p EGFP-N2载体,构建重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1。在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测ns P1a/1基因的表达。结果重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1构建成功;转染p EGFP-N2-ns P1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到ns P1a/1-His融合报告基因的表达。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究ns P1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础。