β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

产β-1,3-葡聚糖酶植物内生放线菌的筛选及抑菌活性研究

本研究采用透明圈法, 对217株植物内生放线菌产β-1,3-葡聚糖酶进行了检测, 结果表明: 45.6%的菌株能够产生β-1,3-葡聚糖酶, 黄瓜内生放线菌中的产酶菌株最多为38个; 不同植物来源的内生放线菌中具有产β-1,3-葡聚糖酶能力的菌株比例不同, 其中黄精中的产酶菌株比例最高, 达到88.9%。产酶菌株粗酶液对油菜菌核病菌的抑菌活性测定结果发现, 36个产酶菌株的粗酶液表现出不同程度的抑制作用, 占总产酶菌株的36.4%, 其中菌株gCLA4的粗酶液能够完全抑制病菌菌丝生长。对gCLA4菌株产酶     

不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:在胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽的N端添加不同类型的信号肽,研究不同信号肽对其在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响。方法:通过融合PCR方法将α成熟交配因子(MFα)、成熟交配因子Pre肽(αPre)和共翻译转运信号肽(Bip信号肽)等3种信号肽的DNA片段连接至胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽基因的5′端,利用PCR扩增包含其自身信号肽的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶基因,将上述4种基因片段分别插入pPIC9质粒,再转化巴斯德毕赤酵母GS115宿主菌并诱导表达;测定胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的活性,检测其表达水平。结果:目前在毕赤酵母中已广泛使用的MFα信号肽介导的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平最高,其次是αPre,Bip信号肽介导的该酶表达水平是酶自身信号肽介导的表达水平的2倍。结论:共转运信号肽能够提高胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的表达水平。     

木霉β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

目的:对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化方法进行研究。方法:粗酶液分别用硫酸铵、乙醇和丙酮进行沉淀,再用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析进一步分离纯化,并用SDS-PAGE法测其分子量。结果:硫酸铵分段盐析法沉淀酶蛋白的效果优于乙醇和丙酮沉淀;盐析得到的酶蛋白经透析浓缩后,再经DEAE-Sepharose CL-6B层析分离,可得到单一酶蛋白,总酶活回收率达78.71%,比酶活达到689.9U/mg,提高了53.74倍,经SDS-PAGE法测得该β-1,3-葡聚糖酶的分子量为80.137kDa。结论:采用硫酸铵分段盐析和离子交换层析法可获得电泳纯的β-1,3-葡聚糖酶,且酶活回收率高。     

啤酒废酵母中β-1，3-葡聚糖的提取工艺

研究采用酶-碱法从经超声波处理的废酵母残渣中提取β-1,3-葡聚糖的工艺,通过正交试验得出理想的酶处理工艺条件：酶添加量208U／g,温度50℃、pH6,酶解8h,蛋白质去除率为62．82％,每L废酵母液中可回收0．348g多肽、氨基酸的蛋白水解液;碱处理工艺条件：用30mL质量分数为2％ NaOH溶液在70℃处理酶解后的沉淀物5h。所得β-1,3-葡聚糖纯度为90．50％,得率为11．00％,经紫外光谱、薄层层析和性质分析为高纯度的β-1,3-葡聚糖。     

小菜蛾幼虫血淋巴中β-1,3-葡聚糖结合蛋白的分离及其对根虫瘟霉侵染的免疫活性

用亲和沉淀法从小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫血淋巴中分离获得2种β-1,3-葡聚糖结合蛋白,分子质量分别为75.9 ku和83.2 ku,主要存在于幼虫血浆中,但血细胞中未检出.研究表明,β-1,3-葡聚糖结合蛋白能特异性地识别β-1,3-葡聚糖,并显著激活幼虫血淋巴中的酚氧化酶原（ProPO）,与昆布多糖共存时所激活的酚氧化酶（PO）活性显著高于两者单独存在时的PO活性.与4株根虫瘟霉(Zoophthora radicans)菌丝裂解液共存时,β-1,3-葡聚糖结合蛋白能激活幼虫血淋巴中的ProPO,使PO活力显著高于该菌原生质体裂解液所激活的PO活性.显然,β-1,3-葡聚糖结合蛋白只有特异性地识别根虫瘟霉细胞壁中的β-1,3-葡聚糖后才能激活幼虫血淋巴中的ProPO,表明虫霉原生质体可逃避寄主免疫反应.此外,β-1,3-葡聚糖结合蛋白对不同菌株所激活的PO活性存在差异,各菌株所激活的PO活性由高到低依次为：ARSEF1342＞ARSEF2699＞F99101＞ARSEF1100,这与各菌株对小菜蛾的毒力强弱相一致,即菌株逃避寄主免疫识别的能力与其毒力相关.     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。     

细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子改造和表达策略

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为一种饲料和食品添加剂有着广泛用途。迄今在杆菌、梭菌、瘤胃细菌、真菌、高等植物中都发现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶。综述了细菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质、结构、分子改造与表达研究进展。     

β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述.     

地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖酶基因的克隆及表达

β-葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖,存在于各种饲料农作物中。作为一种抗营养因子,β-葡聚糖使食糜具有很高的粘度,阻碍肠道消化液与食糜的混合,影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收,降低饲料的利用率。地衣芽孢杆菌分泌的β-葡聚糖酶可分解β-葡聚糖。在青贮发酵过程中,这种酶可降解大麦β-葡聚糖,有效提高家畜、家禽对饲料的利用率。从地衣芽孢杆菌WS-6中克隆到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并进行测序,将该基因与大肠杆菌表达载体pET32a进行连接,转化大肠杆菌BL21,使该基因得到了有效的表达,为进一步在食品级宿主菌中的表达奠定了基础。     

微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

连续温度变化对β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响

为了探索反应温度对产物组分的影响,利用自制连续变化的温度梯度实验装置,研究了22 ℃~60 ℃ (±0.1 ℃) 区间内温度对一内切β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影响,获得了酶解过程多点温度特性数据。分析表明：该酶酶解酵母β-葡聚糖的活化能为84.17 kJ/mol;以产物积累表示的最适酶解温度随时间延长呈指数下降;酶解产物组分受温度的影响,低温较高温获得的寡糖链长,高温区大于46 ℃可以获得以昆布二糖、昆布三糖为主的组分,而低温区小于30 ℃可以获得昆布五糖及更大分子量的产物。研究结果可为寡糖     

小麦叶片β-1,3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性

三个小麦品种331、抗倒680和鲁麦23经氯化汞、水杨酸或核黄素处理后,叶片中的β-1,3-葡聚糖酶活性均有不同程度的升高.氯化汞处理24h对品种331该酶活性的诱导作用最强.因此取用氯化汞处理24 h的331小麦叶片研磨得到粗酶液.将粗酶液经硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析,得到了SDS-PAGE凝胶电泳谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶样品.经SDS-PAGE(12%)和凝胶过滤层析,测得其分子量约为52.0～53.6 kD.抗菌试验测定显示,纯化的β-1,3-葡聚糖酶对供试的4种病原真菌的生长、孢子萌发或芽管伸长都有一定程度的抑制作用.     

真菌β-1,3-葡聚糖合酶——一种抗真菌药物的靶标

真菌β-1,3-葡聚糖合酶（β-1,3-glucan synthase,GS）是由催化亚基和调节亚基组成的酶复合体。在酿酒酵母中GS的催化亚基是由2个序列高度相似的基因FKS1和FKS2编码的,在其他酵母中也存在多个与酿酒酵母FKS相似的基因．而在大多数丝状真菌中只存在1个FKS基因。文中主要介绍酿酒酵母和其他重要真菌中FKS基因的研究进展．对FKS基因的结构、在细胞中的定位、以及调控机制作了概括,并讨论了以真菌β-1,3-葡聚糖合酶为靶标开发新的抗真菌药物的研究现状和发展前景。     

甜菜几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系

应用比较生理学方法,以抗丛根病(rhizomania)性不同的4个甜菜品种为材料,研究了丛根病地和无丛根病地上抗、感病品种的几丁质酶(chitinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)活性与甜菜抗丛根病的关系.抗病品种在病地和无病地上皆比感病品种具有较高的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,表明这两种酶与甜菜抗丛根病性有关;另外,病地上两种酶的活性均不同程度地高于无病地上,是病原物侵染诱导抗性的表现.     

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶,实践证明,转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因植物能比较有效地抵抗真菌侵染。本综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶结构分类、抗真菌机理．及其近年来在抗黄曲霉病研究中的应嗣研究,并对今后的研究及应用进行了预测。