三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及其低温下SA处理后的表达分析

以三明野生蕉(Musaspp.AB group)为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得β-1,3葡聚糖酶5个基因(Mugsp1.2~Mugsp5)的cDNA和DNA序列。序列和生物信息学分析表明Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5的ORF长度分别为1 020、1 047、999、1 023和960bp,分别编码339、348、332、340和319个氨基酸;Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4蛋白具有N端和C端(CTPP)信号肽结构,推测为Ⅰ类β-1,3葡聚糖酶,而Mugsp3只含有N端信号肽,无CTPP结构,Mugsp5则不具有信号肽结构;构建Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4瞬时表达载体并转化洋葱表皮的亚细胞定位观察结果显示,常温下Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4主要在细胞膜、细胞质上表达,而经过8℃低温处理后Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均能够转移至细胞核表达;β-1,3葡聚糖酶基因在不同低温处理下的实时荧光定量(qRT-PCR)检测结果显示,β-1,3葡聚糖酶基因均能响应低温胁迫,是低温胁迫相关基因,但基因间表达水平存在差异;低温下SA处理后的定量结果显示,SA处理会推迟β-1,3葡聚糖酶基因的表达。     

白菜型冬油菜HDACs基因家族的鉴定及表达分析北大核心CSCD

为了研究HDACs(组蛋白去乙酰化酶)在白菜型冬油菜响应低温胁迫中的影响,该研究采用强抗寒品种‘陇油7号’、耐寒品种‘天油4号’和弱抗寒品种Lenox等白菜型冬油菜,分析HDACs抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理后白菜型冬油菜种子的萌发,及低温胁迫下抗氧化酶活性和渗透调节物质含量变化,并全基因组鉴定HDACs的基因家族,分析其在不同抗寒性白菜型冬油菜中的表达特性。结果表明:(1)1μmol/L和3μmol/L的TSA对3个品种的根长均具有抑制作用,不同温度下外源喷施TSA均可增加抗氧化酶活性和渗透调节物质含量。(2)在白菜型冬油菜中共鉴定出21个HDACs;系统发育分析显示,HDACs可分为3个亚家族,所有基因不均等分布在8条染色体上,但7号和8号染色体上没有基因分布;HDACs启动子序列中包含胁迫响应、光响应、激素应答等相关的作用元件。(3)组织表达结果显示,大部分基因在生长锥中表达量明显高于其他组织部位,BrapaHDA19、BrapaHDA6-1、BrapaHDA8和BrapaHDA7-2在白菜型冬油菜花中表达量较高,且BrapaHDA5-2在‘天油4号’的茎生叶、角果、新基叶和老基叶中的表达量较高,而BrapaHDA7-2在Lenox的花中表达量较高。(4)低温胁迫表达结果显示,BrapaHDA8、BrapaHDA14、BrapaHDA2、BrapaHDT2-2和BrapaHDA15-1在3个抗寒性不同的材料中呈现出差异表达。研究推测,所鉴定的这些基因可能在白菜型冬油菜生长发育及抗寒性方面发挥重要功能。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述.     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

不同信号肽对胞外β-(1,3)-葡聚糖酶在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:在胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽的N端添加不同类型的信号肽,研究不同信号肽对其在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响。方法:通过融合PCR方法将α成熟交配因子(MFα)、成熟交配因子Pre肽(αPre)和共翻译转运信号肽(Bip信号肽)等3种信号肽的DNA片段连接至胞外β-(1,3)-葡聚糖酶成熟肽基因的5′端,利用PCR扩增包含其自身信号肽的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶基因,将上述4种基因片段分别插入pPIC9质粒,再转化巴斯德毕赤酵母GS115宿主菌并诱导表达;测定胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的活性,检测其表达水平。结果:目前在毕赤酵母中已广泛使用的MFα信号肽介导的胞外β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平最高,其次是αPre,Bip信号肽介导的该酶表达水平是酶自身信号肽介导的表达水平的2倍。结论:共转运信号肽能够提高胞外β-(1,3)-葡聚糖酶的表达水平。     

枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-4-1能产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2-4-1的基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸.Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%.所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因.DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶活性位点.     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

1,4-β-葡聚糖内切酶基因的克隆及其在麝香百合花粉和花粉管中的特异表达

利用RT-PCR和RACE在麝香百合(Lilium longiflorum Thunb.)花粉管中克隆到1,4-β-葡聚糖内切酶(Endo-1,4-β-glucanase,EGase)的全长cDNA序列(LlpCel1).序列分析结果表明:该基因编码一个含有490个氨基酸的球状蛋白,并在N端有一个由21个氨基酸构成的信号肽序列.序列比对结果显示,LlpCel1和植物分泌型1,4-β-葡聚糖内切酶高度同源(约50%),不含有跨膜结构域和纤维素结合域(CBD).Northern杂交结果显示,该基因的转录本仅在花粉粒、萌发中的花粉和花粉管生长过程中表达,表达量基本相同.而在百合植株其他组织中均未见表达.这种葡聚糖内切酶的高度特异表达说明LlpCel1对花粉萌发和花粉管伸长起着重要作用.     

1,4-β-葡聚糖内切酶基因的克隆及其在麝香百合花粉和花粉管中的特异表达(英文)

利用RT-PCR和RACE在麝香百合(Lilium longiflorum Thunb.)花粉管中克隆到1,4-β-葡聚糖内切酶(Endo-1,4-β-glucanase,EGase)的全长cDNA序列(LlpCell)。序列分析结果表明:该基因编码一个含有490个氨基酸的球状蛋白,并在N端有一个由21个氨基酸构成的信号肽序列。序列比对结果显示,LlpCell和植物分泌型1,4-β-葡聚糖内切酶高度同源(约50％),不含有跨膜结构域和纤维素结合域(CBD)。Northern杂交结果显示,该基因的转录本仅在花粉粒、萌发中的花粉和花粉管生长过程中表达,表达量基本相同。而在百合植株其他组织中均未见表达。这种葡聚糖内切酶的高度特异表达说明LlpCell对花粉萌发和花粉管伸长起着重要作用。     

沙质微泡菌β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质

【背景】β-葡聚糖是自然界中广泛存在的非淀粉多糖,是谷类植物细胞壁的主要成分。β-葡聚糖酶能够水解β-葡聚糖生成低聚合度的寡糖,在食品、饲料、造纸等领域发挥着重要的作用。【目的】从海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)中克隆到一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因,在大肠杆菌中可溶表达,研究其相关酶学性质。【方法】以沙质微泡菌(Microbulbifer arenaceous)基因组DNA为模板,克隆一个β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(MaGlu16A),构建重组表达载体p ET-28a-MaGlu16A并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行酶学性质研究。【结果】MaGlu16A的最适pH和最适温度分别为pH 6.0和40°C,在pH 5.0-10.5和35°C以下稳定。对EDTA具有较高的抵抗性,在1 mmol/L和10 mmol/L EDTA浓度下仍保持99.3%和82.5%的酶活力。该酶能够有效水解可得然多糖、昆布多糖、大麦葡聚糖、地衣多糖、燕麦葡聚糖和酵母葡聚糖,水解产物主要为葡萄糖、二糖、三糖和四糖。【结论】海洋细菌沙质微泡菌(Microbulbiferarenaceous)来源β-1,3(4)-葡聚糖酶的克隆表达及酶学性质的测定为β-葡聚糖酶的挖掘及β-葡寡糖的制备奠定了基础。     

α-萘乙酸对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性的影响

为探究α-萘乙酸(NAA)对植物抗寒性的影响,以白菜型冬油菜‘陇油6号’为试验材料,经4℃、NAA+4℃、NAA+4℃+DPI(NADPH氧化酶抑制剂)、NAA+4℃+DMTU(H2O2清除剂)、NAA+4℃+U0126(MAPK抑制剂)和NAA+4℃+Tungstate(NO生成抑制剂)处理后,研究其对‘陇油6号’油菜的活性氧(H2O2和O2-·)含量,抗氧化酶活性,丙二醛(MDA)、可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量,抗氧化酶基因(APX、CAT、GR、SOD)、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量的影响。结果表明:与4℃低温处理相比,NAA+4℃处理下油菜根系中的细胞活性、H2O2和O2-·含量以及叶片中的MDA含量均降低;根系中的抗氧化酶(CAT、SOD、APX和POD)活性、叶片中的可溶性糖及脯氨酸含量、叶绿素含量、上述相关基因的表达量均升高,说明α-萘乙酸处理油菜可显著提高低温胁迫下油菜幼苗的抗氧化能力、光合能力和相关基因的表达,增强油菜幼苗的抗寒性。与NAA+4℃处理相比,NAA+4℃+抑制剂(DPI、DMTU、U0126和Tungstate)处理下油菜幼苗中叶绿素含量、抗氧化酶基因表达量、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量均呈不同程度降低,说明H2O2和NO信号分子、NADPH氧化酶和MAP激酶级联途径均参与了α-萘乙酸增强油菜幼苗耐寒性过程的调控。     

植物葡聚糖酶基因抗病作用的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶作为植物抗真菌基因工程的热点之一,近年来的研究进展较为迅速。本文叙述了植物β-1,3-葡聚糖酶的基本生物学特性和抗病机制,对β-1,3-葡聚糖酶抗病基因的分类、结构功能及转基因植物的研究进展进行综述。 Advances on the Plant Disease Resistant β-glucanase Gene XING Quan-hua,WANG Bin Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China Abstract:Study of β-1,3-glucanase is one of the hot points in plant genetic engineering of disease resistance,big progress has been made in the past few years.This paper briefly reviewed the main biological characters and mechanism involved in the disease resistance,the classification,structure,function and the transformation of β-1,3-glucanase genes. Key words：β-1,3-glucanase;biological characters;disease resistance mechanism     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子的克隆及功能分析

植物β-1,3-葡聚糖酶属于一种重要的植物病程相关蛋白（PR蛋白）,容易受到激发子的诱导而积累。用1.5 mmol/L水杨酸 （Salicylic Acid,,SA）对花生品种花育20号幼苗进行诱导处理,提取RNA利用 Real-time PCR技术检测β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量。结果表明经诱导后24h,β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量达到最高,是未经SA诱导的1.8倍。根据花生β-1,3-葡聚糖酶基因 cDNA序列（GenBank JQ801335）设计三个嵌套的5＇端特异引物,以花育20号基因组DNA为模板,利用TAIL-PCR方法扩增得到973bp的花生β-1,3-葡聚糖酶基因上游启动子片段, ,命名为Ah-Glu-Pro,,在NCBI网站注册序列号为GenBank KC290400。PLACE 和 PlantCARE 启动子在线预测分析表明,Ah-Glu-Pro序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还含有病原菌及SA响应的顺式调控元件。根据Ah-Glu-Pro序列设计上下游引物,采用普通PCR法从花育20号基因组中扩增得到931bp的启动子序列,命名为Ah-Glu-P。将Ah-Glu-P取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建植物表达载体 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P。通过农杆菌介导法将 pCAMBIA1301-Ah-Glu-P 转化洋葱表皮细胞,经5.0 mmol/L SA诱导处理48h后进行GUS染色。结果表明：经SA诱导后的洋葱表皮细胞GUS染色显示为蓝色,未经诱导的洋葱表皮细胞GUS染色未显示蓝色,说明Ah-Glu-P是一个诱导型的启动子,可能含有对SA响应的顺式调控元件。     

甜菜几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系

应用比较生理学方法,以抗丛根病(rhizomania)性不同的4个甜菜品种为材料,研究了丛根病地和无丛根病地上抗、感病品种的几丁质酶(chitinase)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)活性与甜菜抗丛根病的关系.抗病品种在病地和无病地上皆比感病品种具有较高的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,表明这两种酶与甜菜抗丛根病性有关;另外,病地上两种酶的活性均不同程度地高于无病地上,是病原物侵染诱导抗性的表现.     

α-萘乙酸对低温胁迫下油菜幼苗抗寒性的影响

为探究α-萘乙酸(NAA)对植物抗寒性的影响,以白菜型冬油菜‘陇油6号’为试验材料,经4℃、NAA+4℃、NAA+4℃+DPI(NADPH氧化酶抑制剂)、NAA+4℃+DMTU(H_2O_2清除剂)、NAA+4℃+U0126(MAPK抑制剂)和NAA+4℃+Tungstate(NO生成抑制剂)处理后,研究其对‘陇油6号’油菜的活性氧(H_2O_2和O_2~(-·))含量,抗氧化酶活性,丙二醛(MDA)、可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量,抗氧化酶基因(APX、CAT、GR、SOD)、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量的影响。结果表明:与4℃低温处理相比,NAA+4℃处理下油菜根系中的细胞活性、H_2O_2和O_2~(-·)含量以及叶片中的MDA含量均降低;根系中的抗氧化酶(CAT、SOD、APX和POD)活性、叶片中的可溶性糖及脯氨酸含量、叶绿素含量、上述相关基因的表达量均升高,说明α-萘乙酸处理油菜可显著提高低温胁迫下油菜幼苗的抗氧化能力、光合能力和相关基因的表达,增强油菜幼苗的抗寒性。与NAA+4℃处理相比,NAA+4℃+抑制剂(DPI、DMTU、U0126和Tungstate)处理下油菜幼苗中叶绿素含量、抗氧化酶基因表达量、Rboh A-F、MAPK3/4/6、CBF和ICE1基因表达量均呈不同程度降低,说明H_2O_2和NO信号分子、NADPH氧化酶和MAP激酶级联途径均参与了α-萘乙酸增强油菜幼苗耐寒性过程的调控。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。