中华蜜蜂工蜂cDNA文库的构建及ESTs测序分析

【目的】为了解中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂的抗逆性,构建了中华蜜蜂工蜂的cDNA文库,并对文库质量进行分析。【方法】本研究利用SMART技术构建了中华蜜蜂工蜂的全长cDNA文库。【结果】文库库容为3.6×106 cfu/m L,文库重组率为97%,插入片段长度多数分布在1 000 bp左右。挑取cDNA克隆进行EST测序,共进行了306个成功反应,软件拼接共得到234个单基因簇(Unigene),其中包括207个单拷贝(Singletons)序列及27个重叠群(Contigs)。使用Blastx将这些序列同Gen Bank等数据库进行查询、比对和注释,结果显示141条序列有相关同源性,其他序列没有明显的同源性,这也为我们发现新功能基因提供了可靠依据。【结论】此文库的构建在中华蜜蜂功能基因的分离、克隆、筛选以及基因功能研究等方面具有重要作用。     

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂 Apis cerana cerana Male abnomal 21（mab-21）基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨 Varroa destructor 前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21 cDNA,命名为 Accmab 21（GenBank登录号KR000001）。序列分析显示, 该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 kD和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂 Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。     

中华蜜蜂哺育蜂与采集蜂行为转变相关基因的表达差异研究

【目的】文章旨在寻找中华蜜蜂Apis cerana cerana哺育蜂与采集蜂行为转变相关的重要基因。【方法】选取了8群中华蜜蜂,分别采集哺育蜂和采集蜂,然后通过实时荧光定量PCR对哺育蜂和采集蜂头部中mrjps、Ache、CSP3等22个基因的表达进行了分析。【结果】实验结果表明:mrjp3、mrjp7、Ache、LOC406142、Hbg3、Mblk-1、Ef-1a-f1、TpnCIIIa、Wat、Ant基因在哺育蜂和采集蜂中表达差异极显著(P<0.01),mrjp1、mrjp2、mrjp4、LOC406114、CSP3、Dop1、Jhe、Oa1、Per、TpnT基因在哺育蜂和采集蜂中表达差异显著(0.010.05)。【结论】mrjp3、mrjp7、Ache、LOC406142、Hbg3、Mblk-1、Ef-1a-f1、TpnCIIIa、Wat、Ant、mrjp1、mrjp2、mrjp4、LOC406114、CSP3、Dop1、Jhe、Oa1、Per、TpnT这些表达差异显著的基因很可能与中华蜜蜂哺育蜂与采集蜂的行为转变有关。本研究的结果为我们更好地认识理解蜜蜂行为转变的机制提供思路。     

蜜蜂属六蜂种间MRJP2基因C-端重复序列的比较分析

构建了中华蜜蜂（Apis cerana cerana,中蜂）8日龄工蜂头部cDNA文库,获得了中蜂王浆主蛋白2（major royal jelly protein 2,MRJP2）的全长cDNA序列,该序列长1 605bp,包含一个编码468个氨基酸的开放阅读框（open reading frame,ORF）。在中蜂MRJP2的cDNA序列的C-端,首次发现存在串联重复片段长度多态性（variable numbers of tandem repeat,VNTR）。克隆并测定了蜜蜂属Apis内其他5个种的MRJP2基因的C-端重复序列,结果表明: 在蜜蜂属的其他5个种中,C-端重复片段的核心序列是以碱基高度突变方式而表现出个体之间的多态性,而重复片段长度基本一致。中蜂与西方蜜蜂A. mellifera,大蜜蜂A. dorsata与黑大蜜蜂A. laboriosa,以及小蜜蜂A. florea与黑小蜜蜂A. andreniformis分别形成3个进化枝。中蜂和西方蜜蜂与大蜜蜂和黑大蜜蜂之间的亲缘关系较近,而与小蜜蜂和黑小蜜蜂的亲缘关系较远。     

引入西方蜜蜂对中蜂的危害及生态影响

作者阐述自1896年中国引进西方蜜蜂Apis melliferaL.的优良品种如意大利蜂Apis mellifera ligusticaSpinola和喀尼阿兰蜂Apis mellifera Carnica Pollmann以来,使当地的东方蜜蜂Apis cerana F.受到严重危害,其分布区域缩小75%以上,种群数量减少80%以上。使山林植物授粉总量减少,导致植物多样性减少。文中提出: 建立自然保护区保存本地蜜蜂遗传特性,和采用基因转移等技术,培育具有西方蜜蜂优良生产性能的中蜂新品种,逐步恢复中蜂的种群数量。     

中华蜜蜂细胞色素CYP9E2基因克隆及其表达分析

【目的】克隆中华蜜蜂Apis cerana cerana细胞色素CYP9E2基因的完整编码区序列,分析CYP9E2基因在工蜂体内的表达特征,为研究该基因的生物学功能提供理论基础。【方法】以解剖获得的中华蜜蜂采集蜂中肠组织为材料,提取总RNA。利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂CYP9E2基因的编码区。采用多种生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR)分析其在中华蜜蜂工蜂成虫期不同阶段(初生蜂、哺育蜂、守卫蜂以及采集蜂)头部和中肠组织中的相对表达量及在饲喂氟氯苯菊酯后工蜂中肠组织中的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂CYP9E2基因(命名为Ac CYP9E2)mRNA序列,长度为1 600 bp(Gen Bank登录号:KX394629),编码区长1 494 bp,编码497个氨基酸,其蛋白质分子量为57.026k D,等电点为8.32。系统发育树显示,中华蜜蜂Ac CYP9E2与西方蜜蜂Apis mellifera、小蜜蜂Apis florea CYP9E2基因聚成一支。对中华蜜蜂工蜂成虫期不同阶段头部和中肠组织Ac CYP9E2相对表达量测定发现,该基因在中华蜜蜂工蜂成虫期不同阶段的表达量存在一定差异,其中,采集蜂头部和中肠组织中Ac CYP9E2相对表达量均显著高于初生蜂、哺育蜂以及守卫蜂(P0.05),而且4个阶段工蜂中肠组织中的Ac CYP9E2相对表达量均显著高于其头部(P0.05)。饲喂氟氯苯菊酯后,工蜂中肠组织中Ac CYP9E2的相对表达量显著高于对照组(P0.05)。【结论】推测Ac CYP9E2可能参与了中华蜜蜂机体外源物质的代谢与解毒过程。     

中华蜜蜂及意大利蜜蜂气味结合蛋白OBP12的基因克隆与差异表达分析

【目的】克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)的气味结合蛋白基因OBP12序列,并对两蜂种的蛋白结构进行预测,明确该基因在两蜂种不同组织和发育阶段的表达差异。【方法】分别以中蜂和意蜂的触角cDNA为模板,采用RT-PCR技术扩增和克隆获得OBP12cDNA全长序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术对OBP12在中华蜜蜂和意大利蜜蜂不同发育阶段(1、5、10、15、20、25、30日龄)各组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中mRNA的表达情况进行比较分析。【结果】成功获得了AcerOBP12和AmelOBP12的完整开放阅读框ORF序列,全长均为453bp,共编码150个氨基酸,预测分子量分别为17.76 ku、17.42 ku;N-末端均有一段含22个氨基酸的信号肽,无跨膜结构;均含有6个保守的半胱氨酸位点,属于Classical OBP亚家族。两蛋白均包含6个α螺旋,且由Cys组成的3个二硫键连接在一起。系统进化树分析表明,中华蜜蜂AcerOBP12首先与意大利蜜蜂AmelOBP12聚在一起,再与同为膜翅目的回条蜂HlabPBPGp-9-like、印度跳蚁HsalPBPGp-9-like、阿根廷蚁LhumPBPGp-9-like和小火蚁WaurPBPGp-9-like聚为一类。荧光定量PCR结果显示,OBP12在中、意蜂不同发育阶段各组织中均有表达,且触角中的表达量极显著高于其他组织(P0.01);其他组织中,翅膀和足的表达量相对较高,头、胸和腹中呈微量表达。此外,OBP12在意蜂不同发育阶段各组织的表达量均高于中蜂。【结论】AcerOBP12和AmelOBP12均属于Classical OBP亚家族,推测其为信息素气味结合蛋白PBP。组织表达谱结果暗示,OBP12除广泛参与嗅觉相关行为之外,还可能参与味觉识别过程。     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr170的克隆与序列分析

本研究采用自行设计的引物对中华蜜蜂Apis cerana cerana雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)Ac Or170的c DNA序列进行了克隆和序列分析,以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体Ac Or170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因Ac Or170的c DNA序列总长度为1356 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 k Da,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。     

中华蜜蜂Orco嗅觉受体基因的克隆、表达及亚细胞定位

【目的】克隆鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana的Orco嗅觉受体基因, 并对其在工蜂触角上进行免疫荧光定位。【方法】利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Orco基因, 并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 使用Real-time PCR技术鉴定其在中华蜜蜂不同发育时期及不同组织的表达谱; 利用免疫荧光定位技术在中华蜜蜂工蜂触角中对Orco进行亚细胞定位。【结果】获得中华蜜蜂Orco基因的全长cDNA序列, 命名为AcerOrco (GenBank登录号： JF968610.1), 其全长为1 434 bp, 编码477个氨基酸, 预测其含7个跨膜结构以及4个位于细胞膜外的亲水区。表达谱分析显示, AcerOrco在卵、 幼虫和蛹期呈低丰度表达, 1日龄及内勤蜂时期主要在触角和足中表达, 且在1日龄的触角中表达量最高; 采集蜂时期的触角、 头(去除触角)、 胸、 腹和翅中均有较高丰度的表达。亚细胞定位结果显示, AcerOrco不仅在采集蜂触角鞭节上大量表达（尤其在触角鞭节第1亚节中表达量较高）, 而且常成对出现, 并且发现AcerOrco可能主要在触角毛形感器的外部神经元(outer dendrite, OD)以及板形感器的树突神经元中表达。【结论】成功克隆了AcerOrco基因全长, 获得了其表达谱, 且将其定位于工蜂采集蜂的触角感器神经元上, 最终推测AcerOrco与中蜂嗅觉发育和触角感器功能密切相关。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)与中华蜜蜂(Apis cerana ceraca)的生态位比较

为了明确中华蜜蜂和意大利蜜蜂在皖南山区生态适应性,研究两种蜜蜂的食物生态位、时间生态位和空间生态位及其差异,结果是中蜂与意蜂食物(蜜源植物)资源生态位宽度分别是 0.923、0.765,中蜂对蜜源植物采集喜好性差异小,而意蜂差异大,中蜂对意蜂生态位重迭为0.160,中蜂对意蜂生态位相似性为0.755;油菜花期,中蜂与意蜂时间资源生态位宽度分别是0.879、0.801,枇杷花期,分别是0.760、0.677,中蜂与意蜂的空间资源生态位宽度分别是0.797、0.670.中蜂3种生态位宽度均大于意蜂,中蜂三维生态位值是意蜂的1.61倍和1.57倍.表明中蜂在皖南山区生态适应性比意蜂强.     

中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白基因克隆、组织表达分析及原核表达

为明确中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉形成中重要功能因子的信号转导通路, 本研究利用RT-PCR方法, 克隆了中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白 (sensory neuron membrane protein, SNMP) 基因编码区, GenBank登录号为KC012595, 命名为AccSNMP1。序列分析表明, 该编码区开放阅读框长1 563 bp, 编码520个氨基酸, 推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为58.02 kD和5.83。同源性比较发现, 中华蜜蜂AccSNMP1与其他昆虫感觉神经元膜蛋白基因同源性差异很大, 在氨基酸水平上与西方蜜蜂Apis mellifera SNMP基因一致性达99.2%, 与熊蜂Bombus impatiens SNMP基因一致性达90.9%, 而与赤拟谷盗Tribolium castaneum SNMP基因一致性仅为22.7%。系统发育树显示中华蜜蜂与西方蜜蜂遗传距离最近。实时荧光定量PCR结果分析表明, AccSNMP1在触角中表达量最高, 在足中表达量较高, 与胸、 腹、 头（去除触角和喙）、 喙中表达量相比差异显著（P<0.05）。构建原核表达载体pEASY-E1-AccSNMP1, 经IPTG诱导, 中华蜜蜂感觉神经元膜蛋白在大肠杆菌Escherichia coli BL21 （DE3）中高效表达。结果为进一步研究AccSNMP1在中华蜜蜂体内的作用机理奠定了基础。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4（AcerOBP4）编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法（Neighbor-joining,NJ）构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera OBP4（AmelOBP4）氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原蛋白cDNA的克隆与序列分析

分别从中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera工蜂毒腺中抽提总RNA,通过RT-PCR方法扩增,各得到了蜂毒前溶血肽原蛋白的cDNA,再将扩增产物克隆到pGEM-Teasy载体上,进行测序和序列分析。结果表明,所扩增到的这两个片段长度均为213 bp,均为编码蜂毒前溶血肽原的cDNA,并分别推导出两者所编码的氨基酸序列。经序列比较,中华蜜蜂前溶血肽原与意大利蜜蜂、印度蜜蜂Apis cerana indica前溶血肽原的同源性都为97%。所报道的中华蜜蜂蜂毒前溶血肽原的核苷酸序列的GenBank登录号为AF487907。     

中华蜜蜂的欧洲幼虫腐臭病病原研究

采用中华蜜蜂Apis cerana cerana F.临床自然发病的欧洲幼虫腐臭病(European Foulbrood, EFB)幼虫,对其病原体进行了分离鉴定。结果表明：中华蜜蜂EFB的病原系蜂房蜜蜂球菌Melissococcus pluton。该菌为革兰氏阳性的兼性厌氧菌,形态学及染色特性、致病性试验、血清学试验和细菌DNA G+C mol%试验均证明中华蜜蜂和西方蜜蜂的EFB病原属于同属的蜂房蜜蜂球菌。生理生化特性结果与国外的早期研究结果相近似。该试验为不同地理位置、不同种寄主间蜂房蜜蜂球菌的遗传差异的研究,以及中华蜜蜂EFB病的防治学研究打下基础。     

中华蜜蜂DNA甲基化转移酶Dnmt3基因克隆及表达谱分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana的DNA甲基化模式, 本研究采用RT PCR技术克隆了中华蜜蜂DNA甲基化转移酶3（Dnmt3）基因(GenBank登录号为JQ740768); 采用荧光定量PCR检测不同发育时期工蜂（4日龄蛹, 1, 7和30日龄成年蜂及产卵工蜂）和蜂王（4日龄蛹, 1日龄蜂王和产卵蜂王）头部的Dnmt3基因mRNA的表达量。结果表明： 该基因cDNA序列全长2 277 bp, 编码758个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为88.24 kD, 等电点为7.85。将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对, 同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析, 发现与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99%。该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达, 1日龄工蜂与7日龄工蜂中没有显著差异(P>0.05), 30日龄工蜂中的表达量显著高于前两者 (P<0.05); 蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹 (P<0.05); 1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂(P<0.05); 产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（P>0.05）。这种表达情况提示其可能与工蜂劳动分工及蜜蜂卵巢发育有关。