中华蜜蜂PLA2基因的生物信息学分析及响应高温胁迫的表达模式

磷脂酶A2 (PLA2)对细胞膜流动性、膜蛋白活性等细胞生理功能有重要调节作用。高温等环境压力对细胞的生理代谢有较大的影响,其在生物体抗逆过程中的调控作用一直备受关注。本研究以中华蜜蜂Hymenoptera: Apidae: Apis cerana cerana PLA2基因序列为基础,对其蛋白结构进行预测,分析该基因在不同温度和高温不同胁迫时间下的表达差异,以揭示该基因在中华蜜蜂抗高温过程中的生理功能。结果显示,中华蜜蜂PLA2基因包含745 bp的开放阅读框,编码169个氨基酸,蛋白分子量为19.3 kDa,无跨膜结构,不属于膜蛋白。氨基酸同源序列比对结果显示,中华蜜蜂PLA2序列与蜜蜂科昆虫的相似性最高,与其他膜翅目昆虫的相似性存在差异。qRT-PCR结果显示,PLA2在35℃、40℃和45℃处理下的表达量较高,较高的温度能诱导该基因表达的增加。同时,PLA2的表达受高温胁迫时间的影响,较长时间的高温胁迫导致PLA2基因的表达增加。本研究结果表明PLA2在中华蜜蜂应对高温胁迫时发挥重要生理功能。     

大蜡螟触角转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】大蜡螟Galleria mellonella Linnaeus是世界范围内蜂群中普遍存在的害虫,给世界养蜂业带来了巨大的危害。本研究旨在建立大蜡螟触角转录组数据库,挖掘大蜡螟嗅觉相关基因,为今后利用嗅觉基因靶标防治大蜡螟提供分子生物学信息数据。【方法】利用高通量测序平台(Illumina HiSeqTM 2500)对大蜡螟触角进行转录组测序和组装,通过筛选转录组数据库,鉴定出嗅觉相关基因。【结果】成功构建了大蜡螟触角转录组,经序列拼接获得188 278条unigenes,平均长度为781 bp,N50为1 161 bp。使用BLAST软件将大蜡螟触角unigenes序列与7大公共数据库比对,共注释到108 047条unigenes,其中NR数据库注释的unigenes最多,为78 746条,占41.82%,且NR注释的大蜡螟unigenes中与家蚕Bombyx mori类似基因最多,为18.4%。将unigenes与GO数据库比对发现,共有69 794条unigenes注释到GO数据库中,按照其所参与的生物过程、细胞组分和分子功能对其进行GO功能分类,共含有55个亚类,其中参与结合和催化功能及代谢过程的unigenes比例较大;KEGG代谢途径分析表明,14699条unigenes形成231条代谢通路,其中被注释在信号传导通路中的unigenes最多,为2 401条,占16.33%。进一步基因注释分析,鉴定得到226个候选嗅觉相关基因,包括52个气味结合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)基因,36个化学感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)基因,80个气味受体(Odorant receptors,ORs)基因,56个离子型受体(Ionotropic receptors,IRs)基因和2个感觉神经元膜蛋白(Sensory neuron membrane proteins,SNMPs)基因;通过比较雌、雄大蜡螟转录组鉴定出114个差异表达基因,包括5个嗅觉相关基因(OBP8、OBP17、CSP3、CSP34和OR15);114个差异表达基因中,66个基因在雌蛾触角中高表达,48个基因在雄蛾触角中高表达。【结论】本研究获得了大蜡螟触角转录组数据,并鉴定出候选嗅觉相关基因,结果为进一步研究大蜡螟的基因功能及嗅觉感受机制奠定分子基础。     

中华蜜蜂气味受体AcerOR57的表达及定位分析

为研究中华蜜蜂气味受体AcerOR57的表达及定位,利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测气味受体AcerOR57 mRNA及蛋白在1日龄工蜂和雄蜂、采集蜂及性成熟雄蜂各部位(触角、头、胸、腹和足)的相对表达量;通过免疫组织化学技术检测该基因受体蛋白在中华蜜蜂触角中的表达定位。结果表明:AcerOR57转录本在1日龄工蜂和采集蜂,1日龄雄蜂和性成熟雄蜂各部位均有表达,但表达程度不一:在1日龄工蜂、采集蜂的触角和1日龄雄蜂、性成熟雄蜂的头部中高丰度表达,均极显著高于其它部位(P0.01);Western blot结果显示,AcerOR57受体蛋白在1日龄工蜂和采集蜂触角中的表达量高于其它部位,这与荧光定量PCR结果相一致;但该蛋白在1日龄雄蜂和性成熟雄蜂的触角和头部表达均不明显,与mRNA水平表达结果相反;免疫组化结果显示,AcerOR57在工蜂和雄蜂触角的毛形感器、板形感器和锥形感器中表达。在1日龄工蜂和性成熟雄蜂中,毛形感器所占的比例大于板形感器,说明其主要在毛形感器中表达;在1日龄雄蜂和采集蜂中,板形感器的表达量比毛形感器表达量多,说明其主要在板形感器中表达;除采集蜂外,其它样本中均发现少量锥形感器的表达。推测AcerOR57可能在探测外界气味分子中发挥一定的作用,这为进一步研究气味受体的功能提供了理论依据。     

中华蜜蜂及意大利蜜蜂气味结合蛋白OBP12的基因克隆与差异表达分析

【目的】克隆获得中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)的气味结合蛋白基因OBP12序列,并对两蜂种的蛋白结构进行预测,明确该基因在两蜂种不同组织和发育阶段的表达差异。【方法】分别以中蜂和意蜂的触角cDNA为模板,采用RT-PCR技术扩增和克隆获得OBP12cDNA全长序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术对OBP12在中华蜜蜂和意大利蜜蜂不同发育阶段(1、5、10、15、20、25、30日龄)各组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中mRNA的表达情况进行比较分析。【结果】成功获得了AcerOBP12和AmelOBP12的完整开放阅读框ORF序列,全长均为453bp,共编码150个氨基酸,预测分子量分别为17.76 ku、17.42 ku;N-末端均有一段含22个氨基酸的信号肽,无跨膜结构;均含有6个保守的半胱氨酸位点,属于Classical OBP亚家族。两蛋白均包含6个α螺旋,且由Cys组成的3个二硫键连接在一起。系统进化树分析表明,中华蜜蜂AcerOBP12首先与意大利蜜蜂AmelOBP12聚在一起,再与同为膜翅目的回条蜂HlabPBPGp-9-like、印度跳蚁HsalPBPGp-9-like、阿根廷蚁LhumPBPGp-9-like和小火蚁WaurPBPGp-9-like聚为一类。荧光定量PCR结果显示,OBP12在中、意蜂不同发育阶段各组织中均有表达,且触角中的表达量极显著高于其他组织(P0.01);其他组织中,翅膀和足的表达量相对较高,头、胸和腹中呈微量表达。此外,OBP12在意蜂不同发育阶段各组织的表达量均高于中蜂。【结论】AcerOBP12和AmelOBP12均属于Classical OBP亚家族,推测其为信息素气味结合蛋白PBP。组织表达谱结果暗示,OBP12除广泛参与嗅觉相关行为之外,还可能参与味觉识别过程。