鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1高表达抑制黑素瘤细胞在小鼠体内的生长

鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antienzyme inhibitor-1,OAZI-1)是细胞内调节多胺代谢的重要蛋白质因子。已有研究发现,OAZI-1高表达的黑素瘤细胞在体外能更有效地被抗原提呈细胞识别和吞噬,提示OAZI-1在肿瘤免疫治疗中具有潜在的应用价值。为进一步分析OAZI-1高表达对黑素瘤细胞在小鼠体内生长的影响,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞(B16/OAZI-1)被接种到实验小鼠体内,结果发现,接种瘤出现先成瘤随后逐渐消退的现象,至第24 d时,接种瘤的平均体积为36±25 mm3~,而对照细胞接种瘤的平均体积为326±309 mm~3。为探索上述现象的机制,随后分析了B16/OAZI-1在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫效应,结果发现:1)B16/OAZI-1接种显著增加了小鼠脾脏细胞对B16-F1瘤细胞的杀伤活性;2)源于B16-F1的细胞抗原能更有效地促进B16/OAZI-1接种小鼠脾脏细胞的增殖;3)B16/OAZI-1接种小鼠的脾脏细胞具有更强的分泌IFN-γ的能力;4)当在预接种B16/OAZI-1 30 d后的小鼠体内再次接种B16-F1活细胞时,新接种瘤细胞的生长受到显著抑制,小鼠的存活率增加。上述研究结果提示,高表达OAZI-1的黑素瘤细胞在实验动物体内的生长受到显著抑制,其机制可能与OAZI-1能促进肿瘤抗原提呈和诱导抗肿瘤免疫效应相关。     

豹蛙核酸酶与斑蝥酸钠对肺腺癌细胞增殖的协同抑制作用

豹蛙核酸酶(onconase,Onc)是从美洲北方豹蛙卵母细胞中提取的一种核糖核酸酶,对许多肿瘤细胞都具有杀伤作用。斑蝥素(cantharidin)是存在于芫青科昆虫斑蝥体内的一种天然防御性毒素,斑蝥酸钠(sodium cantharidate,SCA)是斑蝥素半合成衍生物。鉴于Onc与SCA对非小细胞肺癌都具有杀伤作用,采用MTT法测定Onc与SCA单独与联合作用于两株肺腺癌细胞的IC50值,运用联合作用指数(combination index,CI)和等效线分析评价两者联合作用的效果。结果表明,Onc与SCA联合作用时,CI值均小于0.7,等效线分析图显示,代表Onc与SCA联合作用的点均位于加成线下方,Onc与SCA对肺腺癌SPC-A-1、A549细胞株增殖的抑制作用具有协同效应。用流式细胞仪进行的凋亡细胞检测结果也支持上述"Onc/SCA联合使用具有协同抗癌作用"的结论。     

桑根酮D对肿瘤细胞及移植瘤生长作用研究

研究桑根酮D的体内外抗肿瘤作用。采用的体外实验,桑根酮D溶液体外共培养三种癌细胞(人肝癌HepG2细胞、小鼠黑色素瘤B16F0细胞、小鼠黑色素瘤B16F10细胞),采用SRB法(Sulforhodamine B)检测桑根酮D对肿瘤细胞增殖的影响,计算IC_(50)。对黑色素瘤细胞(B16F0和B16F10细胞)给予不同浓度的桑根酮D,考察其对黑色素含量的影响。采用的体内实验,建立小鼠H22肿瘤模型并分组,三个剂量的桑根酮D分别为12.5、25、50 mg/kg,考察其对肿瘤生长的抑制作用。结果显示,桑根酮D抑制B16F0、B16F10、HepG2细胞增殖,HepG2细胞对桑根酮D最敏感,得IC_(50)为22.61±0.26μmol/L。随着桑根酮D浓度的增加,抑制细胞的作用增强且均有显著性差异(P0.01)。桑根酮D促进B16F0细胞内黑色素生成,促进细胞分化。12.5、25、50 mg/kg剂量的桑根酮D对小鼠肝癌细胞H22移植瘤抑制率为32.51%～45.72%。给药组小鼠的体重及各脏器指数变化与空白对照组和模型组比较均无显著性差异。得出结论,桑根酮D具有体内外抗肝癌作用和促进肿瘤细胞分化的作用。     

体外大量制备新型gp96肿瘤疫苗及其诱导的特异性抗肿瘤免疫应答分析

旨在体外组装酵母菌表达的gp96 (Recombinant gp96,rgp96) 蛋白与B16.F10黑色素瘤抗原,大量制备新型gp96肿瘤疫苗,并研究其诱导的特异性抗肿瘤免疫应答。利用体外组装的rgp96-肿瘤抗原复合物免疫C57BL/6小鼠,并通过酶联免疫斑点实验、细胞因子染色、杀伤实验技术进行分析,结果显示与单纯rgp96或肿瘤抗原免疫组相比,体外组装的rgp96-肿瘤抗原复合物免疫能够显著抑制B16肿瘤的生长,而且能够明显提高肿瘤特异性T细胞活性。rgp96-肿瘤抗原复合物的抗肿瘤免疫活性与从肿瘤组织中提取的gp96接近。研究结果为大量制备新型gp96肿瘤疫苗提供了依据。     

纤黏连蛋白重组多肽CH50抑制黑色素瘤MMP-2和MMP-9表达、激活的研究

目的 研究纤黏连蛋白重组多肽CH50对黑色素瘤B16细胞侵袭能力的影响,探讨CH50多肽抑制肿瘤生长、侵袭的机制。方法 体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞、小鼠腿部皮下注射B16细胞建立肿瘤动物模型。采用明胶电泳法检测B16细胞和黑色素瘤组织中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活;以CH50多肽体外处理B16细胞或体内表达CH50,观察CH50下调MMPs表达以及对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。结果 B16细胞在体外培养条件下主要表达MMP-2,而在肿瘤微环境中则同时表达MMP-2和MMP-9。肿瘤组织中MMPs的表达明显高于体外培养B16细胞。CH50多肽对体外培养B16细胞的MMPs表达和激活无明显抑制作用,但处理后的B16细胞进入体内后表达MMPs的能力受到明显抑制。体内转染表达的CHSO多肽亦可明显抑制肿瘤表达MMPs、并抑制肿瘤侵袭能力。结论 纤黏连蛋白重组多肽CHSO可以抑制肿瘤微环境中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活,从而抑制黑色素瘤生长及侵袭能力。     

叶柄粘球菌STXZ77的分离鉴定及抗肿瘤活性

目的：从土样中分离纯化粘细菌,对其进行鉴定与归类,以丰富粘细菌菌种资源,并对其进行抗肿瘤活性初步研究,为抗肿瘤药物开发奠定基础。方法：采用灭活大肠杆菌诱导法,从土样中分离纯化粘细菌,结合形态观察、生理生化特征及16S rRNA基因序列同源性分析进行菌株鉴定;向发酵液上清中加入XAD-16大孔吸附树脂提取发酵产物粗提物,CCK-8法进行体外抗肿瘤活性研究;RP-HPLC分离抗肿瘤活性组分,LC-MS/MS分析其分子质量。结果：分离并鉴定了STXZ77菌株,命名为Myxococcus stipitatus STXZ77。该菌株的发酵产物XAD-16树脂粗提物对小鼠黑色素瘤细胞B16、小鼠乳腺癌细胞4T1、人肝癌细胞SMMC-7721、人宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞SW480等多种肿瘤细胞具有较好的细胞毒性,作用24h的IC₅₀值分别为5.34μg/ml、13.50μg/ml、11.93μg/ml、28.70μg/ml、48.09μg/ml,而对正常细胞人脐静脉血管内皮细胞HUVEC的毒性较小,IC₅₀值为17.09μg/ml,小于B16、4T1及SMMC-7721的细胞毒性。RP-HPLC分离得到抗肿瘤活性组分AP-C,质谱分析其分子质量为422.99m/z。结论：从土样中分离得到粘细菌Myxococcus stipitatus STXZ77,从该菌中分离得到抗肿瘤活性组分AP-C,具有开发成抗肿瘤药物的潜在价值。     

痂囊腔菌素A对动物实体肿瘤的光动力治疗

从生物学角度研究了痂囊腔菌素A（EA）对黑色素瘤B-16实体肿瘤的光敏生物活性,实验结果显示,EA对黑色素瘤B-16实体肿瘤生长具有良好的抑制、杀伤效果,表明EA具有光敏抗肿瘤活性。     

小鼠γ干扰素/上皮生长因子受体结合域融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性的提高

采用基因工程和蛋白质工程技术,构建了一种新颖的小鼠γ干扰素/上皮生长因子受体结合域融合蛋白,该蛋白保留了完全的抗病毒活性,达到10~8IU/L菌液;利用~(125)I-mEGF进行的受体结合竞争抑制实验,证明融合蛋白所带有的上皮生长因子结合域有与EGF竞争结合受体的功能;体外抗乳腺癌细胞增殖实验证明融合蛋白具有比干扰素母体分子更明显的抗肿瘤细胞增殖效应;在小鼠B16黑色素瘤模型上,融合蛋白和干扰素母体治疗后的2组小鼠,平均瘤体重量分别为1.6和2.6g,具有统计学差异.表明融合蛋白具有比干扰素母体分子更强的体内肿瘤生长抑制作用.     

过表达核糖核酸酶抑制因子通过调节ILK/PI3K/AKT信号途径抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞体内外生长

核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor,RI）是胞浆内的一种酸性蛋白质.已有研究证明,RI与核糖核酸酶A（RNaseA）和血管生成素（angiogenin,ANG）结合可抑制其活性.本室前期实验证实,RI可有效抑制某些肿瘤的生长和转移. 然而,RI抑制肿瘤的分子机制尚不清楚. 本研究探讨RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞生长和凋亡的影响及其机制. MTT法结合流式细胞术分析结果证明,RI基因稳定转染导致B16+F10黑色素瘤细胞S期阻滞,抑制B16-F10黑色素瘤细胞增殖. Annexin V/PI结合流式细胞术结果显示,RI过表达引起细胞凋亡.与此相一致,蛋白质印迹分析显示,过表达RI引起抗凋亡分子Bcl-2表达下调,而Bax上调,同时伴有Pro-casepase 3激活. C57BL/ 6小鼠移植成瘤实验显示,与对照相比,转染RI的B16-F10细胞形成的肿瘤重量显著减少,同时伴有肿瘤组织微血管密度降低.提示RI过表达能抑制微血管生成. 此外,体内外组织/细胞免疫化学和蛋白质印迹结果揭示,过表达RI可显著抑制整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)下游靶分子Akt和GSK-3β的磷酸化,并降低β-联蛋白的表达.研究结果证明,过表达RI可通过抑制ILK/ PI3K/AKT信号通路,促进细胞凋亡,引起S期阻滞,并抑制血管生成,从而显著抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞在体内、外的生长.上述结果提示,RI可能是治疗黑色素瘤的有效分子靶点.     

重组可溶性TRAIL的表达与生物学活性

研究重组可溶性TRAIL的抗肿瘤生物学活性。采用基因分子生物学方法构建重组可溶性TRAIL的表达载体,建立大肠杆菌表达菌株,采用柱层析等方法获得纯化的重组可溶性TRAIL;采用流式细胞术、细胞活性测定法和体内药效学实验分析重组可溶性TRAIL杀伤肿瘤细胞的生物学活性。结果表明重组可溶性TRAIL在体外可诱导人白血病细胞和肝癌细胞凋亡,凋亡率达50%以上。中枢神经系统的肿瘤细胞对重组可溶性TRAIL不敏感。重组可溶性TRAIL在体内能显著抑制人非小细胞肺癌细胞在小鼠体内生长,抑制率达70%以上。结论为研究制备的重组可溶性TRAIL能在体内外杀死多种肿瘤细胞,具有显著的临床应用前景。