应用氯化锶和放线菌酮对小鼠卵母细胞进行孤雌活化的研究

本试验研究了SrCl_2浓度和作用时间,以及卵龄和蛋白合成抑制剂放线菌酮等对昆明种小鼠卵母细胞活化的影响。研究表明,以含1.6mmol/L SrCl_2的无钙M16液对小鼠卵母细胞活化效果最好(87.0％),显著(P<0.05)优于SrCl_2浓度为1.0、5.0、10.0mmol/L的同种液体。SrCl_2作用时间10分钟显著(P<0.05)好于5、20、30或60分钟。注射hCG后18和20小时卵母细胞的活化率(分别为87.0％和84.6％)显著(P<0.01)高于14或16小时的活化率(分别为4.8％和16.5％)。CHX与SrCl_2联合使用产生显著的协同促进卵母细胞活化作用。     

几种因素对电刺激诱导小鼠卵母细胞孤雌活化的影响

为了给小鼠体细胞核移植研究提供最佳的小鼠卵母细胞电激活条件 ,研究了影响电刺激诱导小鼠卵细胞孤雌活化的 4个因素 :脉冲强度、电融合液、操作液预处理及小鼠品系。发现 :(1)小鼠卵母细胞在 0 5～1 2 5kV/cm脉冲强度下 ,获得的活化率差异不显著 (71 4 3%～ 80 39% ,P >0 0 5 ) ,而在 1 5kV/cm的脉冲刺激下 ,活化率显著下降至 4 8 15 % (P <0 0 5 ) ,死亡率显著升高 (2 9 6 3% ,P <0 0 5 ) ;(2 )含有山梨醇的EFS1和含有甘露醇的EFS2对小鼠卵母细胞的活化效果相似 ,但前者较后者更易于操作 ,可以用EFS1取代EFS2运用于小鼠体细胞核移植研究中 ;(3)用核移植操作液预处理小鼠卵母细胞后 ,在 0 75kV/cm的脉冲强度下 ,与对照组无差异 ,而当脉冲强度升至 1 0kV/cm时 ,活化率显著降低 (46 6 7% ,P <0 0 5 ) ,而死亡率显著升高(30 0 0 % ,P <0 0 5 ) ;(4)昆明白小鼠和C5 7BL/ 6小鼠卵母细胞在 0 75～ 1 0kV/cm场强下 ,活化率无差异。     

Leptin对陕北白绒山羊体细胞核移植的影响

Leptin的功能较为复杂,主要调控机体能量代谢。有研究表明Leptin在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中也具有重要作用。本研究在卵母细胞体外成熟基础培养液中添加了不同浓度的Leptin,其中未添加Leptin的设为Ⅰ组,添加10ng/mL和50ng/mL Leptin的分别设为Ⅱ组和Ⅲ组。以陕北白绒山羊皮肤成纤维细胞为供体细胞,三组体外培养成熟的卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到卵周隙内,经电融合后形成体细胞克隆胚。根据卵母细胞体外成熟率、核移植效率以及克隆胚囊胚发育率分析Leptin在山羊核移植中的作用。结果表明Ⅰ组山羊卵母细胞体外成熟率和核移植效率显著高于其他两组(P<0.05),三组克隆囊胚发育率无显著差异(P>0.05)。Leptin降低了山羊卵母细胞体外成熟和核移植效率,对克隆胚发育能力无影响。     

完整的供体细胞膜及供体胞质对小鼠体细胞克隆胚发育的影响

利用显微注射和电融合的方法都可以成功地获得体细胞克隆小鼠, 由于电融合法操作耗时, 融合率低, 因而大多数克隆小鼠是采用注射方法。而注射法需要将供体细胞核从细胞中分离出来, 此分离操作有可能导致对DNA的损伤, 曾有人使用直径较粗的注射管进行完整的供体细胞注射, 这种方法操作相对简单而且对供体核没有损伤。为了研究这种方法在小鼠核移植中是否适用, 本实验使用完整的小鼠卵丘细胞作供体, 进行显微注射, 结果显示, 完整的卵丘细胞注入卵母细胞后, 无论在1小时或者6小时激活, 大部分的重构胚在2细胞期碎裂, 而去掉细胞膜的供体体细胞核注入卵母细胞后, 重构胚可以卵裂并进一步发育。卵母细胞去核后不注射供体也发生碎裂, 大部分的孤雌胚(不去核)在完整的卵丘细胞被注入后同样发生碎裂。在供体卵丘细胞刚破膜后即被注入卵胞质和供核被充分剥离后注入两种情况下获得的重构胚的体外发育中, 前者发育各期的比率显著低于后者。这些结果说明完整的卵丘细胞膜阻碍了卵胞质对体细胞核的重编程作用, 造成碎裂; 注入卵胞质的供体质膜和胞质成分影响了克隆胚的体外发育。     

牛体细胞核移植显微操作环节的优化

本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。     

不同因素对大鼠卵母细胞孤雌激活作用影响的研究

本实验比较了SrCl_2,放线菌酮(CHX),电刺激和乙醇等理化因素对SD大鼠卵母细胞激活的作用。结果表明,SrCl_2,CHX和电刺激均能有效激活SD大鼠卵母细胞,其最高激活率分别达到93.24％,91.89％和85.90％。8％乙醇对注射hCG 21小时后的卵母细胞激活率也达70％。SrCl_2在1.6和3.2mmol/L浓度,作用10—30分钟均有较好激活效果。电刺激强度在160V,80μs作用较佳。当SrCl_2与CHX联合作用时,激活率可有明显提高。但电刺激或乙醇与CHX的联合作用不能有效提高激活 率。本研究还比较了卵丘细胞的存在与否对激活的影响,发现卵丘-卵母细胞复合体中的卵母细胞不能被有效激活。刚离体的超排卵母细胞也不能被有效激活,须在体外培养一定时间后才能被激活。     

小鼠体细胞核移植程序的研究

采用直接去核法、透明带切割法、PMM法3种核移植方法进行小鼠卵母细胞去核的研究。3种方法都未对卵母细胞核进行示踪,仅以第一极体作为参照进行去核,都属于盲吸法范畴,在去核率上没有显著差异。直接去核法对卵母细胞造成较大的伤害,去核操作过程中极易使卵母细胞膜破裂,发生崩解;透明带切割法分步操作使操作变得柔和,对卵母细胞的刺激减小,去核卵母细胞的存活率较高;PMM法靠脉冲电压在透明带上打孔进行辅助去核,脉冲参数稍大或压透明带太紧都极易在击破透明带的同时击破卵膜,使卵母细胞发生崩解。在构建重构胚的过程中,胞质内注射法较电融合法而言,程序简单,带入的供体胞质较少,构建重构胚的效率更高。     

核移植胚胎干细胞的研究及其应用前景

随着核移植技术和干细胞技术的逐渐成熟,目前已获得牛、小鼠核移植胚胎干细胞,以及人 - 兔异种间核移植胚胎干细胞,这些细胞在体外可分化成多种细胞形态 . 已经进行的实验性动物克隆性治疗,显示了诱人的潜力,但人核移植胚胎干细胞研究还面临着许多问题,如建系效率低、卵母细胞来源有限以及伦理学和安全性问题等 . 长远地看,随着克隆效率的提高,在道德与法律之间达成共识,核移植胚胎干细胞必将造福人类 .     

用小鼠血液淋巴细胞构建核移植重构胚的研究

本实验用小鼠血液淋巴细胞为核供体进行了核移植研究。用淋巴细胞分离液(比重1.088)分离出小鼠血液中的淋巴细胞,直接用作核移植供体细胞,采用胞质内注射法成功构建的重构胚经常规培养2h后,SrCl_2激活处理6h,然后添加mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养。把发育至早期囊胚阶段的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,添加ES细胞培养液继续培养。对孵化出的内细胞团进行消化,然后接种培养。结果显示,小鼠血液淋巴细胞可以支持体细胞核移植重构胚的发育,核移植重构胚2-细胞率41.03%(128/312),桑葚胚和囊胚发育率分别为9.29%(29/312),1.92%(6/312)。重构囊胚在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上分离出2个内细胞团,分离率为0.64%(2/312)。实验证实利用小鼠血液淋巴细胞进行体细胞核移植是可行的,可用于深入研究。     

小鼠母源因子对早期胚胎发育的影响

在脊椎动物中发育过程中,卵母细胞要经历MII期停滞、受精、早期胚胎发育的启动、胚胎基因组的转录激活、并指导完成个体的发育过程。同时,核移植过程中,分化的细胞核在去核的卵母细胞中能够重编程到胚胎早期的状态并能完成个体的发育过程。在这些发育过程中母源因子都发挥了极其的重要作用。在小鼠胚胎发育研究中发现,小鼠的基因组激活发生在2细胞期,这一时期标志着合子的发育由卵母细胞控制向胚胎控制的过渡,期间发生一系列复杂的生化过程。体外培养的小鼠的胚胎的发育阻断也易发生的2细胞时期。因此对卵母细胞及早期胚胎母源因子的研究,将有利于了解早期体外培养胚胎和克隆胚胎发育失败的原因,为提高体外培养和克隆胚胎发育的成功率提供理论的基础。     

多种神经活性物质在幼年猫和鸡视网膜神经细胞中的共存(简报)

视网膜起源于前脑泡,结构简单层次分明,因此常被视为脑的简化模型。但近期工作证明,视网膜包含的神经活性物质(神经递质、调质和神经肽)种类之多、分布之复杂并不亚于脑。尤其是无长突细胞不仅包含多种递质和肽类,而且还有递质与肽类或肽类与肽类在一个细胞中的共存。对视网膜神经递质、调质和神经肽的研究将是探索脑奥秘的有效途径。     

注射装载孕酮的红细胞膜泡诱发蟾蜍卵成熟的研究

中华大蟾蜍长足的卵母细胞,经注入装载水相孕酮的红细胞膜泡,能被诱发成熟;直接注入水相孕酮的卵母细胞,无能恢复成熟分裂。将蛋白酶处理的红细胞制备成装载水相孕酮的膜泡,注入卵内,照样能诱发其成熟分裂;然而,分别用根皮素结合或磷脂酶A_2水解红细胞膜磷脂,制备的膜泡,虽亦包裹着水相孕酮,但注射的卵母细胞都未能被诱发成熟。这些结果表明,在通过红细胞膜转运孕酮诱发卵母细胞成熟过程中,红细胞膜上的某些膜蛋白可能不是必要的成份,而膜磷脂类却是关键成份,它不仅可能保证孕酮不被迅速代谢,且保证孕酮从卵母细胞内部诱发成熟分裂。     

低分子量神经丝蛋白(NF-L)的体外组装

利用超速离心和离子交换层析技术,从牛脊髓中分离纯化了神经丝蛋白三组分:NF-L,NF-M和NF-H。应用电镜负染色和金属投影方法研究神经丝的形态结构与NF-L的体外组装,结果表明:神经丝由10nm的核心纤维与外周的丝状突起组成;在近似生理条件下,NF-L可在60min内组装成10nm纤维,纤维由4根亚丝缠绕而成;在碱性缓冲液中,NaCl能促进NF-L装配成短纤维,这种10nm的短纤维无法连接成长纤维。     

金鱼精子质膜和核膜的区域特异性

本文结合采用扫描和透射电子显微镜(包括冷冻断裂-蚀刻、超薄切片以及细胞化学染色法),研究了金鱼精子的超微结构特征,结果表明金鱼精子的质膜和核膜都具有区域特异性:1)精子质膜内大部分区域含有许多蛋白颗粒,但在特定区域内,蛋白颗粒呈有序排列,构成晶格状结构。2)精子头颈部和尾部均有液泡密集之处,凡是覆盖着液泡区的质膜内,几乎都不含有蛋白颗粒。3)液泡区能被细胞化学方法染成致密色,表明内含糖蛋白。4)核膜孔只集中存在于靠近颈部的核膜上,而其他部分则没有。本文对上述诸点进行了讨论。     

偏凸-柱穗山羊草双二倍体SDAU18的细胞分子遗传学鉴定

综合利用细胞学、种子贮藏蛋白电泳、基因组原位杂交（GISH）和抗性接种鉴定相结合的方法．对偏凸-柱穗山羊草双二倍体SDAU18进行了鉴定。结果表明,SDAU18的根尖细胞染色体数目变异范围为52—56．在绝大多数根尖细胞染色体数目为56的SDAU18减数分裂中期I花粉母细胞fPMCMI）内可观察到28个二价体,在部分细胞中可观察到一定频率的单价体、三价体和四价体,平均染色体构型为2n=56=3．21I＋19．78IIRing＋6．50IIRod＋0．01III＋0．04IVRing＋0．01IVRod;在SDAU18种子贮藏蛋白电泳图谱中,亲本偏凸山羊草和柱穗山羊草的多数特异带能够出现,SDAU18高分子量麦谷蛋白亚基图谱中既出现双亲的亚基谱带．也观察到新型亚基谱带：分别利用偏凸山羊草和柱穗山羊草基因组总DNA作探针．另一个亲本基因组总DNA作封阻。对SDAU18根尖细胞制片进行染色体原位杂交．在SDAU18的56条染色体中分别有14条出现绿色杂交信号：SDAU18是偏凸山羊草和柱穗山羊草的双二倍体,对小麦白粉病和条锈病均表现免疫,是一个在小麦品种遗传改良中具有重要利用价值的新型种质材料。     

血管内皮生长因子蛋白在大鼠睾丸和附睾的表达和定位研究

为探讨血管内皮生长因子(VEGF)在雄性生殖系精子发生发育和成熟过程中的调控作用,应用免疫组化、Periodic acid-Schiff(PAS)染色及蛋白质免疫印迹技术,检测VEGF蛋白在成年大鼠睾丸和附睾的表达和定位情况。Western-blots显示,在大鼠睾丸和附睾内均有VEGF蛋白(约45kD)的表达;免疫组化显示,睾丸内VEGF见于圆形和长形精子细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞,免疫阳性产物位于细胞质内。精子细胞的VEGF表达伴随精子细胞顶体发育的全过程,精子残余体呈强阳性。附睾内VEGF表达于附睾管上皮,且有区域和细胞特异性。附睾起始段的所有上皮主细胞内都有VEGF阳性颗粒;头、体、尾各段的VEGF阳性细胞多数与含PAS阳性颗粒的细胞重合,证明为亮细胞;近端附睾的管腔内可见精子头部呈VEGF阳性染色。睾丸、附睾间质血管内皮为VEGF阴性。上述结果表明,VEGF蛋白可由生殖细胞和附睾管上皮细胞直接产生,它可能以自分泌和/或旁分泌的形式共同作用于睾丸和附睾的生殖细胞和血管内皮,直接或间接影响精子的发生、发育和成熟过程,特别是精子顶体的形成过程,并可能与精子在附睾内的成熟有关。     

荧光脂质体导入黄瓜悬浮细胞原生质体的研究

用“脱水再加水法”制成包裹荧光黄的脂质体,通过PEG诱导融合或保温共培养法,成功地将脂质体导入了黄瓜悬浮细胞原生质体。PEG处理组摄入脂质体的细胞可达80—90%,其中50—60%的细胞荧光较强,均匀一致。脂质体/原生质体保温共培养半小时,荧光细胞达95%以上,荧光较弱,在细胞中呈点状分布,3—4天后脂质体逐渐破裂,点状荧光变为均匀一致的荧光。导入荧光黄脂质体的原生质体经持续分裂形成愈伤组织和胚状体,进一步分化出芽和根。     

Molecular structure for microbial polysaccharides: conformation of the Klebsiella serotype K9 capsular polysaccharide

Fibre type X-ray diffraction patterns have been obtained from oriented, semicrystalline films prepared from the sodium salt form of the bacterial capsular polysaccharide of Klebsiella serotype K9. The molecule has a pentasaccharide repeating sequence, with four neutral residues in the backbone and a glucoronic acid side chain. A novel feature of the molecule is the incorporation of α-l-rhamnose residues, one 1,2 linked and two 1,3 linked in the backbone. Analysis of the X-ray diffraction results indicate an extended three-fold helical conformation with an axially projected chemical repeat of 1.377 nm. Both left and right handed helices have been examined using linked atom least squares techniques to optimize the stereochemistry while simultaneously meeting the observed helical parameters.     

细胞骨架对凝血酶诱导人血小板分泌反应的调节(英文)

本文利用血小板表面外露的GMP-140为血小板分泌反应的特异性标志,通过放射免疫分析法定量测定血小板表面GMP-140分子数,研究了细胞骨架抑制剂对凝血酶诱导血小板分泌反应的影响。结果表明,凝血酶激活使血小板表面GMP-140的外露明显增加,反应迅速,并在一定范围内呈剂量和时间依赖性;而ADP刺激则几乎不引起GMP-140外露的增加。凝血酶激活前加入不同的细胞骨架抑制剂处理可产生不同的效应:细胞松驰素B(肌动蛋白微丝抑制剂)可明显上调凝血酶诱导的GMP-140外露;而秋水仙素(微管抑制剂)则下调GMP-140的外露;两者同时处理仍呈现明显的上调作用。提示凝血酶作为一种强激活剂,不仅可通过受体-G蛋白-第二信使的途径启动血小板分泌反应,而且可能经诱导肌动蛋白微丝的形成对分泌反应起反馈性负调节作用。微管的存在则可能对凝血酶诱导的分泌反应起促进作用。虽然两种细胞骨架的作用相反,但以微丝的作用为主,两者间无相互拮抗现象。     

盐胁迫诱导的植物细胞凋亡--植物抗盐的可能生理机制

近来的研究表明,一定条件的盐胁迫可导致植物细胞程序性死亡。本文利用DNALaddering、石蜡切片原位检测以及染色体涂片原位检测,从组织、细胞以及DNA等多个方面对盐胁迫下的玉米、水稻和烟草根尖细胞死亡作了研究,形态特别是生化方面的证据表明盐胁迫诱导的植物细胞凋亡可能在植物界具有一定的普遍性。但各个物种之间有一定差异。本实验结果对盐胁迫下的植物生理机制提供了新的研究思路。同时,我们还对基于染色体制片和石蜡切片的原位检测方法进行了比较和讨论。我们认为,基于染色体制片的原位标记技术适合于定性和定量检测单个细胞的凋亡,具有一些石蜡切片所不可及的优点。