糖蛋白G 基因在基因组P-M 位的插入重组表达对狂犬病毒Flury LEP 致病力的影响

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对重组病毒的生物学特性及对小鼠的致病性进行了初步研究。【结果】亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×106 FFU/mL和2.5×106 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×107 FFU/mL和2.5×107 FFU/mL;嗜神经指数均为1;Western blot显示,rLEP-PGM在感染细胞的G蛋白表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的LD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的LD50分别为4×104 FFU和3.2×105 FFU。【结论】P、M基因之间插入一个额外的G基因能够提高G蛋白的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入中枢神经系统的能力。     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

用于狂犬病单克隆抗体中和活性检测病毒库的制备及初步应用

以狂犬病街毒株为攻击病毒建立检测狂犬病单克隆抗体中和活性的方法。小鼠脑内接种分离扩增狂犬病阳性标本24株;分离到的街毒株在N2A细胞进行培养及病毒滴度测定,选择能够适应N2A细胞生长且滴度较高的街毒株建立病毒库;建立方法后对TRN006单克隆抗体进行3次检测,评价其重复性。24份狂犬病阳性标本均分离成功;只有15株病毒能够适应N2A细胞,并在细胞上形成荧光灶;最终选取10株滴度较高病毒建立病毒库,该病毒库覆盖了中国9个不同省份及四个中国毒株群;用其中三种病毒对狂犬病单克隆抗体进行中和活性检测3次,T检验发现其具有良好的重复性。     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

狂犬病病毒Vero细胞适应株3aG-V的致病性和免疫原性

狂犬病病毒3aG—V株是3aG—5在vero细胞适应的毒株,对其在小鼠、豚鼠、家兔、犬的不同感染途径的致病性,小鼠、豚鼠、兔子上的免疫原性进行研究,同时进行纯毒及在中枢神经系统中能否形成尼氏小体试验,结果表明：狂犬病病毒3aG—V株潜伏期较长,在动物脑内不形成尼氏小体,为固定毒,其在实验动物上具有较弱的致病性和较好的免疫原性,可作为纯化Vero细胞狂犬病疫苗的生产用疫苗株。     

肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）病毒株的筛选及其免疫原性研究

选用在Vero细胞上初步适应的LR1（Ⅰ型）、R22（Ⅱ型）株病毒,经乳鼠脑或腹腔接种,收剖感染鼠脑并在Vero细胞传代适应,此收获病毒与直接以Vero细胞传代的病毒比较表明：抗原效价、毒力滴度有明显提高。用LR1、LR22株病毒感染的Vero细胞培养物制备单价粗制疫苗和双价精制纯化疫苗免疫家兔,经空斑减少中和试验检测中和抗体,结果表明经乳鼠和Vero细胞交替传代适应后的LR1、R22株病毒具有良好的抗原性和免疫原性。     

云南省甲属披膜病毒的特性

从云南省分离的甲属披膜病毒,在蚊、鼠、猴等多种动物细胞和人细胞中均能增殖,并能在营养琼脂覆盖的鸡胚细胞和Vero细胞中形成空斑;在小白鼠体内具有组织泛嗜性;在蔗糖中的浮力密度为1.17g/cm~3。体内外试验都表明,该病毒增殖速度快。用低滴度(4.0 log TCID50)或高滴度(7.0 log TCID50)病毒,脑内或皮下注射乳鼠均能稳定致死,唯低滴度者的潜伏期略长于高滴度者。3周鼠脑内或皮下注射病毒虽不死亡,但在体内能检测出病毒及特异性抗体。     

季节性流感病毒 H1N1 BALB / c 鼠肺适应株的建立及其分子机制简

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究.方法 以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株.结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变.结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用.     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株,并对适应的分子机理进行研究。方法以病毒滴鼻感染小鼠,通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,观察小鼠存活情况及肺病理改变,来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株,经过在小鼠体内进行8次传代后,毒力逐渐增强,从无致病力到致死率达到100%,对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对,发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株,HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

流行性出血热病毒对乳鼠致病特点的观察

本文观察了两株从病人体内新分离的流行性出血热(EHF)病毒114株和435株对乳鼠的致病特点,并在感染的乳鼠脑内找到了EHF病毒。免疫荧光检查发现,病毒抗原广泛存在于感染鼠的脑、肺、肝、肾等脏器。脑内和腹腔两条感染途径的比较发现,病毒抗原在上述脏器中的分布基本一致,但前者脑内的病毒感染滴度较后者高一个对数单位。对病毒的动态观察发现,EHF病毒首先在乳鼠腹腔感染6小时后的腹腔巨噬细胞(Mφ)中分离到、并持续阳性;病毒血症出现在感染后2天,随之在脑、肺、肝、肾和脾脏中查到。以上结果表明:EHF病毒对乳鼠具有广泛的嗜性,脑内感染途径能获得较高滴度的感染性病毒。提示EHF病毒在鼠mφ中增殖并携带至全身播散,可能是造成乳鼠全身性弥漫性感染的主要原因。     

我国新分离乙型脑炎病毒株毒力特征研究

将分离自不同年代的17株乙脑毒株在小鼠脑内传代,然后将病毒在BHK21细胞单层上观察不同毒株的空斑形成大小形态,小鼠脑内和皮下途径接种观察病毒的毒力,结果显示不同毒株在BHK21细胞上形成的噬斑大小不尽相同,减毒株形成的噬斑最小。所有毒株对小鼠的脑内毒力都很强,病毒滴度高达lg8.0/mL以上,毒株间无明显差异。毒株对9～11g小日龄小鼠的皮下毒力有一定差异但不明显,但对14～16g较大日龄小鼠则差别明显。PFU/LD50的对数值差异除一株(M47株)为8.44外,其余各株差别在3.94～0.45间。本研究结果证明自然界乙脑毒株存在明显的神经外毒力差异,毒力差异与分离年代和病毒基因型无关,但从人体分离到的毒株毒力表现较强。     

一株强神经毒力乙脑病毒株的生物学及其分子特征

研究一株神经毒力很强的乙型脑炎病毒株SA4株的生物学特性并进行基因组全序列分析,并找到其毒力强的分子基础。将SA4脑内接种昆明小鼠后每日观察发病和死亡鼠数并每日收取鼠脑,用空斑法检测接种后不同时间点的脑内病毒增殖滴度,同时以另一株乙脑病毒SA14按照相同方法进行平行实验作为对照。SA4株的全基因组测序序列结果与乙脑SA14株及世界各地共21株乙脑病毒的全基因组序列进行比较。结果显示,脑内接种SA4株的小鼠发病和死亡时间均比SA14株早1d,在相同时间点上SA4株的病毒滴度高0.5～1.0lgPFU/mL。SA4株与世界各地毒株基因同源性比对,核苷酸同源性为84.6%～99.0%,氨基酸同源性为95.2%～99.7%。与SA14相比,氨基酸序列存在17个位点的差异,分布于不同的区段,其中E区最多,为5个。证明SA4是一株在脑内具有较快繁殖力的神经毒力很强的毒株,其序列上17个氨基酸位点的替换很可能是其强神经毒力的分子基础。     

流行性出血热(EHF)Ⅱ型疫苗生产中病毒株及原液的质控检测

流行性出血热Ⅱ型纯化疫苗(即亚单位疫苗)系用Ⅱ型Hautaan病毒R_(22)SM株感染乳鼠脑精制而成。为了保证疫苗生产和质量控制,我们对病毒株的繁殖量,感染度,毒力及纯毒株的中和指数作了实验性检测,依据检测的结果:用Ⅱ型EHF毒株R_(22)SM株乳鼠脑内接种感染后的第4或5天病毒在脑内开始出现,而大量繁殖则在接种感染后第7～8。其单一鼠脑内病毒繁殖量(病毒滴度)和制成单一收获原液中病毒含量基本相一致;脑内病毒滴度log LD_(50)为9.7;原悬液中病毒滴度log ID_(50)为11.2,纯毒试验的特异性中和指数为1378。如上所述,各种实验检测结果完全符合EHF疫苗生产规程指标要求。     

BALB/C乳鼠作为流行性出血热动物实验模型的初步研究

用EHF病毒76/118株、陈株、H_(8278)株、,A_(54)株经脑内注射BALB/C小鼠,乳鼠均能发生感染,并引起规律性发病,表现为耸毛、个体瘦小、动作迟缓、后肢麻痹僵直,直至死亡。在乳鼠脑、肺、肝等脏器内均可检出病毒抗原,并可分离出病毒,传3代的乳鼠脑悬液经VeroE—6细胞滴定,病毒滴度有明显增高,说明Balb/C乳鼠对EHF病毒是敏感的,可作为EHF的实验动物模型。幼鼠和成鼠虽然也能感染EHF,但在脑、肺、肝等脏器中均查不出病毒抗原,而抗体水平却很高,最高可达1∶1280。     

云南森林脑炎病毒的动物敏感性研究

本文对分离自云南的森林脑炎病毒进行了动物敏感性研究,实验证明云南森林脑炎病毒对小白鼠有较强的致病性,三日龄乳鼠无论经脑内、腹腔、皮下接种均能致病、死亡,但毒力较国内森林脑炎病毒标准株低;三周龄小白鼠经鼻腔接种亦能发病致死。对乳大白鼠、幼年豚鼠和金黄色地鼠能引起发病或死亡,病毒抗原定位主要在脑组织。病理检查表明感染的各种动物脑组织均有明显病变。此外,对鸡胚敏感,能引起BHK_(21)、Vero、Vero-E_6等传代细胞及人胚肾、乳猪肾原代细胞的CPE_0结果表明了云南森林脑炎病毒对细胞、动物的致病性与国内森林脑炎病毒标准株相似,仅毒力稍低。     

中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础。利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析。测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因Ⅰ型;CTN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV18的同源性最低,仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性最高,达93.4%。系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内。G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗。     

小鼠对重组痘苗病毒表达流感病毒血凝素的免疫反应

实验比较了小鼠对表达流感病毒A/NJ/11/76(H1N1)和A/Jap/305/57(H2N2)血凝素基因的痘苗病毒重组株HSW2和VInf1的免疫反应,两株重组病毒经静脉或静脉加鼻腔免疫小鼠后都产生相应血凝抑制抗体;用不同剂量的痘苗病毒重组株HSW2皮内接种家兔也产生相应抗体,且抗体滴度与接种的病毒量成正比关系,但用痘苗病毒野毒株免疫的家兔未测到抗体,这两株痘苗病毒重组株免疫的小鼠,能保护小鼠对流感病毒母株的攻击,HSW2和VInf1的保护指数分别为3.3和3.9个对数,但这两株病毒未能诱导细胞毒性T细胞反应。     

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

乙脑/寨卡嵌合病毒包膜蛋白T120A位点突变对小鼠脑内神经毒力的影响

为探索包膜蛋白T120A突变对乙脑/寨卡嵌合病毒JEV/ZIKV小鼠脑内神经毒力的影响,应用重叠延伸PCR和分子克隆技术构建含T120A突变的乙脑/寨卡嵌合病毒全长cDNA质粒,经酶切、测序鉴定后,以其为模板体外转录制备RNA,电转染导入BHK21细胞,收获培养液上清获得突变病毒株JEV/ZIKV (T120A)。分别用JEV/ZIKV和JEV/ZIKV (T120A)感染BHK21细胞,绘制病毒增殖曲线,比较蚀斑大小;脑内接种昆明鼠,比较病毒小鼠脑内神经毒力差异。突变病毒感染性克隆经酶切鉴定表明成功构建,增殖曲线发现:突变病毒高峰滴度为5.59 log_(10)pfu/mL,低于JEV/ZIKV的峰值(6.8 log_(10)pfu/mL),JEV/ZIKV (T120A)的小鼠脑内神经毒力LD_(50)为1.38 PFU(0.03 mL),JEV/ZIKV病毒LD_(50)为2.21 PFU(0.03 mL)。研究表明寨卡病毒包膜蛋白T120A突变降低了乙脑/寨卡嵌合病毒的复制能力,但却轻微增强了病毒小鼠脑内神经毒力。     

犬瘟热病毒CDV-3株感染性克隆的构建与鉴定

以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性c DNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础。设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增。经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pc DNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得CDV-3株的全长c DNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3)。构建表达CDV-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒。利用转染试剂Lipofectamine~(TM) 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3 d后,将上清接种到Vero细胞。观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定。最后,比较wtCDV-3和rCDV-3的生长特性。全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确。拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rCDV-3株。rCDV-3的病毒滴度最高达到10~(7.667) TCID_(50)/mL,比wtCDV-3的滴度10~(6.667) TCID_(50)/mL高出约10倍。rCDV-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度。而wt CDV-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大。文中建立的高效CDV-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础。