大豆种子萌发过程中的差异蛋白质组研究

运用蛋白质组学技术对大豆(Glycinemax)N2899种子萌发0h、8h、36h、60h4个时期蛋白质的差异表达情况进行了研究.结果发现,在考马斯亮蓝染色的双向电泳pH3～10胶上,PDQuest图像分析软件可识别的点约350个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白质点有24个,而绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未降解.在萌发的第一阶段,24个差异表达蛋白中有10个蛋白质的丰度发生变化.第二阶段,差异表达蛋白的种类和量增加,其中15个蛋白质是动态变化的,14个蛋白质在胚根突破种皮时表达量达到峰值,表明吸胀后种子内的生命活动越来越强.对这24个蛋白质点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定均获得肽质量指纹图谱.搜索大豆的UniGene库初步鉴定出6个蛋白质,分别是核苷二磷酸激酶、热激蛋白、硫氧还蛋白、35ku种子成熟蛋白及种子成熟蛋白PM36.对这些蛋白质在种子萌发过程中可能的作用进行了讨论.     

PVA和PEG(6000)预处理对大豆胚轴生长、蛋白质合成和ATP含量的影响

在低温吸胀阶段,经PVA(聚乙烯醇)和PEG(聚乙二醇6000)预处理的大豆胚轴蛋白质合成和ATP含量均比对照高。在萌发阶段,胚轴生长增快,蛋白质合成明显加快,ATP迅速被消耗,而对照胚轴则相反。试验结果表明,预处理大豆种子萌发和生长与其蛋白质合成、ATP水平和消耗能力有密切关系。     

豌豆种子吸胀过程中脱水耐性变化的时间模式

研究了豌豆种子吸胀过程中脱水耐性的变化模式。种子在吸胀初期迅速吸收水分,然后缓慢吸收直到平台期。电解质渗漏速率在吸胀初期增加直到11h,然后随着吸胀下降。在吸胀过程中,种子的萌发率逐渐增加,种子和胚轴的脱水耐性逐渐丧失,10％和50％的种子和胚轴被脱水致死的含水量明显增加。赤霉素和脱落酸处理改变豌豆种子的萌发特性,提高胚轴的脱水耐性。研究结果表明,吸胀的豌豆种子脱水耐性的丧失是一种数量性状,正常性种子吸胀后脱水耐性的变化能够作为种子顽拗性研究的模式系统。     

苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆及其非生物胁迫下的表达分析

根据苦荞花期转录组数据,采用RT-PCR技术和PCR技术克隆得到一条新的b HLH类蛋白基因FtbHLH3(登录号:KU296217),并分析了逆境胁迫下该基因在芽期苦荞胚轴和子叶中的表达量。结果显示,Ftb HLH3基因cDNA全长1 273 bp,包含一个957 bp的开放阅读框,编码蛋白含318个氨基酸。蛋白结构域分析表明,FtbHLH3编码蛋白N-端和C-端分别含有一个bHLH家族典型的结构域。系统进化树分析表明,FtbHLH3与其它植物参与抗逆的bHLH蛋白聚为一簇。荧光定量PCR分析表明,UV-B处理苦荞后,胚轴中FtbHLH3相对表达量在6 h内缓慢增加至1.08,12 h后显著上升至48 h的2.96;而子叶中FtbHLH3相对表达量在3 h后就显著上升,至24 h达到最大值6.64后趋于稳定。4℃冷处理苦荞后,胚轴和子叶中FtbHLH3相对表达量均随时间持续上升,并在48 h后达到最大值,分别为3.22和10.27。可见,本研究克隆的Ftb HLH3基因可能参与了苦荞对UV-B和寒冷等非生物胁迫的应答反应。     

生菜种子低温处理后耐冻性和脂肪酸合成代谢的关系研究

以生菜(Lactuca sativa)种子为研究对象,通过不同时间的吸水处理分析其含水量变化,再通过程序降温处理,分析不同含水量种子发芽率的差异,以及脂肪酸合成有关基因(FAD2、FAD3、PPT、ELOVL)和冷调节基因ICE1的表达。结果表明,种子含水量随吸水时间增加而升高。程序降温至同样的低温冷冻条件下(-20℃、-22℃),吸水时间小于6 h的种子发芽率较高,而吸水8 h以上的种子发芽率显著降低。种子吸水8 h含水量处于饱和状态,在此状态下种子对低温较为敏感,说明含水量对种子耐冻性有影响。冷冻处理后生菜种子基因表达检测结果表明,脂肪酸去饱和酶基因(FAD2、FAD3)、蛋白质棕榈酰基硫脂酶相关基因(PPT）、长链脂肪酸延伸酶相关基因(ELOVL)的表达水平均随着种子含水量增加呈上升趋势,吸胀10 h的种子表达量最高,此时种子由于高含水量所受冷冻伤害最大。基因ICE1在冷冻处理种子中的表达也随着吸水时间增加而升高,在吸水10 h时种子中表达量到最高水平。综上,种子含水量越高,所受冷冻伤害越大。但种子在低温条件下具有一定的抗冷反应,可通过相关基因的过表达调控合成更多不饱和脂肪酸、抗冻蛋白等提高含水种子耐冻性。     

大豆PM34基因生物信息学预测及表达分析

以大豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR法从吉豆2号品种中克隆获得大豆种子成熟蛋白( PM34)基因序列,利用生物信息学方法对大豆PM34基因编码的蛋白进行预测。结果表明：该基因编码蛋白理论分子量为31.7 kDa,等电点为6.60,为亲水性蛋白;该蛋白中无跨膜结构;该蛋白中不存在信号肽。 PM34基因编码蛋白的二级结构中α螺旋占12.97％,无规则卷曲占41.30％,β折叠占45.73％。 PM34基因编码蛋白的三级结构预测表明,同源模建的模板是3ijr.1.A,是一种短链脱氢酶/还原酶,与该蛋白的同源性为54.65％。在进化关系上,与绿豆、苜蓿的亲缘关系相对较近。采用实时定量PCR方法( qRT-PCR),检测大豆PM34基因在大豆各器官中的表达方式,结果表明该基因在大豆根、茎、叶、花中的表达活性低,而在种子中,尤其是成熟种子中的相对表达活性很高。该研究结果为大豆PM34基因结构和功能的进一步研究奠定了基础。     

高压静电场（HVEF）对大豆种子吸胀冷害的影响

高压静电场预处理可不同程度地提高大豆种子抗低温吸胀冷害的能力,处理组种子在低温吸胀时无机离子,可溶性糖和可溶性蛋白的外渗量显著低于对照组,静电场预处理还提高了种子中过氧化氢酶（简ＣＡＴ）、过氧化物酶（简ＰＯＤ）、超氧物歧化酶（简ＳＯＤ）等清除自由基的酶活性,降低了丙二醛（简ＭＤＡ）的积累,促进了种子代谢水平,即提高了种子的淀粉酶、脱氢酶的活力和可溶性蛋白含量,最终提高了发芽率。本文以膜的相变和损伤     

苦豆子和披针叶黄华种子硬实特性与活力关系研究

以苦豆子和披针叶黄华种子为实验材料,在恒温25℃下吸胀,每24h取出吸胀种子,10d后未吸胀的种子为硬实种子(H),硬实种子用硫酸处理后恒温吸胀24h,与非硬实种子进行发芽试验和各项活力指标测定。结果显示:(1)每日内吸胀的种子数量随时间推移以一定比列下降,苦豆子非硬实种子吸胀速率较缓慢,第10天后吸胀率降到1%,披针叶黄华非硬实种子第3天后下降到1%,第9、10天突然上升后又下降到1%。(2)两种豆类种子都显示出硬实种子发芽率、发芽指数、活力指数、脱氢酶、呼吸速率、超氧化物歧化酶(SOD)均高于非硬实种子,而电导率、浸出液可溶性糖和丙二醛(MDA)均低于非硬实种子,缓慢吸胀的硬实种子活力指标高于快速吸胀的硬实种子。研究表明,硬实种子活力高于非硬实种子,硬实种子吸胀过程中存在吸胀损伤。而在非硬实种子中,根据以上活力指标判断,晚吸胀的种子比早吸胀的种子活力高。     

采用酵母双杂交系统筛选GmDREB5的互作蛋白

以无自激活活性的GmDREB5蛋白73～226位氨基酸区段为诱饵,采用酵母双杂交系统筛选干旱处理5 h大豆cDNA文库.结果发现:一个互作蛋白含有保守的TPR(Tetratricopeptide repeat)结构域,与拟南芥的TPR蛋白仅有14%的相似性,说明其可能是一类新的大豆TPR蛋白,将其定名为GmTPR1;表达特性分析表明,GmTPR1基因受干旱、低温、高盐、ABA的诱导;证明GmTPR1不仅参与植物对非生物胁迫的响应,同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控.     

预吸胀对绿豆种子脱水耐性的影响

绿豆 (Vignaradiata)种子的吸水曲线未出现明显的“平稳期”。种子萌发 5 0 %的时间和热时间分别为 11h和 11 5度天。在吸胀初期 ,种子的相对电导率迅速增加 ,然后下降。随着脱水时间的延长 ,预吸胀不同时间的绿豆种子的含水量和存活率、由存活种子产生的幼苗鲜重、胚根和下胚轴长度明显下降 ;而且随着预吸胀时间的增加 ,种子对脱水的敏感性显著加强 ;预吸胀种子的相对渗漏率在脱水初期缓慢增加 ,然后迅速增加 ,且预吸胀时间愈长 ,相对渗漏率增加的幅度愈大。结果表明预吸胀的绿豆种子的脱水耐性是逐渐丧失的 ;吸胀的能萌发的正常性种子的脱水敏感性可以作为研究种子顽拗性的一种模式系统     

Expression of the soybean allergenic protein P34 in Escherichia coli and its indirect ELISA detection method

To detect the soybean allergen P34 (Gly m Bd 30K) from soybean products, the full-length cDNA sequence of P34 was synthesized and inserted into the prokaryotic expression vector pET-28a. The P34 protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) as an inclusion body under the induction of 0.8 mmol/L isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside. After purification with His-Bind affinity chromatography, the purity quotient of the recombinant protein was over 92 %, and its molecular weight (approximately 33 kDa) was very close to that of the native soybean P34. The polyclonal antibody (pAB) against P34 was prepared with the purified recombinant P34. The generated pAB, named as pAB-P34, exhibited high specificity to the P34 protein of the soybean meal. The indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) based on pAB-P34 was established to determine the P34 content of soybean products. The CVs of the recovery tests of P34 were less than 7.77 %, which indicated that iELISA had high reproducibility and accuracy. Therefore, the recombinant P34 produced in the E. coli expression system, the prepared pAB-P34, and the developed iELISA could provide a valuable tool for sensitive detection of P34 in various soybean products and for future studies on allergies related to soybean P34.     

大豆蛋白含量新位点qPRO-19-1的定位

大豆是重要的粮食作物和经济作物,其籽粒蛋白约为40%,是植物蛋白的重要来源之一。国产大豆主要用于食用,提高大豆蛋白含量是主要的育种目标。因此,发掘大豆蛋白含量相关基因,对开发分子标记并培育高蛋白食用大豆具有重要意义。本研究以低蛋白大豆品种中黄35为母本,以源自日本的高蛋白大豆十胜长叶为父本,构建了重组自交系(RIL,recombination inbred lines)群体。利用集群分离分析法(BSA,bulked segregant analysis)在3条染色体筛选出9个与蛋白含量相关的SSR标记,其中位于19号染色体的QTL尚未见报道。进一步利用完备区间作图法(ICIM-ADD)分析RIL群体F_2:15和F_2:16,在19号染色体重复定位了1个蛋白质含量相关QTL qPRO-19-1,位于分子标记SSR_19_38和SSR_19_59之间,LOD值分别为3.43和3.98,贡献率分别为7.81%和14.87%,高蛋白等位基因来自于高蛋白亲本十胜长叶。qPRO-19-1的定位区间长度为385 kb,共有注释基因36个。本研究定位了蛋白质含量相关的新位点qPRO-19-1,为大豆高蛋白基因的图位克隆及分子标记育种奠定了基础。     

Ribosomal proteins L34 and S29 of amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense: cDNAs cloning and gene copy number

The complete cDNA and deduced amino-acid sequences of ribosomal proteins L34 (AmphiL34) and S29 (AmphiS29) from the amphioxus Branchiostoma belcheri tsingtauense were identified in this study. The AmphiL34 cDNA is 435 nucleotides in length and encodes a 118 amino-acid protein with calculated molecular mass of 13.6 kDa. It shares 53.6-67.5% amino-acid sequence identity with its eukaryotic counterparts including human, mouse, rat, pig, frog, catfish, fruit fly, mosquito, armyworm, nematode and yeast. The AmphiS29 cDNA comprises 453 nucleotides and codes for a 56 amino-acid protein with a calculated molecular mass of 6.6 kDa. It shows 66.1-78.6% amino-acid sequence identity to eukaryotic S29 proteins from human, mouse, rat, pig, zebrafish, seahorse, fruit fly, nematode, sea hare and yeast. AmphiL34 contains a putative nucleolar localization signal, while AmphiS29 has a zinc finger-like domain. A phylogenetic tree deduced from the conserved sequences of AmphiL34 and AmphiS29 and other known counterparts indicates that the positions of AmphiL34/AmphiS29 are intermediate between the vertebrate and invertebrate L34/S29. Southern blot analysis demonstrates the presence of one copy of the L34 gene and 2-3 copies of the S29 gene in the genome of the amphioxus B. belcheri tsingtauense. This is in sharp contrast to the existence of 7-9 copies of the L34 gene and 14-17 copies of the S29 gene in the rat genome. These date suggest that housekeeping genes like AmphiL34 and AmphiS29 have undergone large-scale duplication in the chordate lineage.     

球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）XP_322380和赤霉菌（Gibberella zeag）PH-1（EAA76971）的60S核糖体蛋白L10a基因（60S ribosomal protein L10a,RPL10a）蛋白序列对球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌RPL10a cDNA序列。cDNA序列长765bp,开放阅读框654bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分了量为23．9kD。BlastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89％;与玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）相似性最低为78％。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录（登录号分别为AY669070,AAT74578）。     

Effect of exercise and obesity on skeletal muscle amino acid uptake

The genetically obese Zucker rat has a reduced capacity to deposit dietary protein in skeletal muscle. To determine whether amino acid uptake by muscle of obese Zucker rats is impaired, soleus strip (SOL) and epitrochlearis (EPI) muscles from 10-wk-old lean and obese Zucker rats were studied in vitro by use of [14C]alpha-aminoisobutyric acid (AIB). Muscles from fasted rats were incubated under basal conditions at rest or after a 1-h treadmill run at 8% grade. To equate total work completed, lean and obese rats ran at 27 and 20 m/min, respectively. Muscles were pinned at resting length, preincubated for 30 min at 37 degrees C in Krebs-Ringer bicarbonate buffer containing 5 mM glucose under 95% O2-5% CO2, and then incubated up to 3 h in Krebs-Ringer bicarbonate with 0.5 mM AIB, [14C]AIB, and [3H]inulin as a marker of extracellular fluid. Basal AIB uptake in EPI and SOL from obese rats was significantly reduced by 40 and 30% (P less than 0.01), respectively, compared with lean rats. For both lean and obese rats, exercise increased (P less than 0.05) basal AIB uptake in EPI and SOL, but the relative increases were greater in the obese rats (EPI 54% and SOL 71% vs. EPI 32% and SOL 37%). These results demonstrate that genetically obese Zucker rats have reduced basal skeletal muscle amino acid uptake and suggest that physical inactivity may partially contribute to this defect.