水产品中河流弧菌分离株OmpU基因的克隆测序与生物信息学分析

目的 对河流弧菌(Vibrio fluvialis)水产品分离株OmpU基因进行克隆测序和生物信息学分析,为建立该菌的检测方法和研制疫苗奠定基础.方法 从市售水产品中分离细菌,采用表型和分子鉴定方法确定其种属,并测定其致病性和药物敏感性.根据弧菌属OmpU基因的序列特点,设计引物扩增河流弧菌OmpU基因,将其克隆到T载体上,筛选重组质粒并对其进行序列测定及生物信息学分析.结果 从水产品中分离的2个菌株(Vf1和Vt2)经鉴定确认为河流弧菌,它们均具有致病性,对15种测试抗菌药物敏感.2株河流弧菌OmpU基因全长分别为1 044和1 005 bp,含有1个开放性阅读框,分别编码由348和335个氨基酸组成的OmpU蛋白,该蛋白N端前22个氨基酸为信号肽.序列比对结果显示2株河流弧菌OmpU基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列相似性分别为82.6％和81.2％.OmpU蛋白序列在6种弧菌种内和种间的相似性分别为81.4％ ～ 99.2％和71.2％ ～78.1％.表位预测结果显示河流弧菌OmpU蛋白的B细胞线性表位主要集中在第24 ～ 28、45～ 53、113～116、153～156、215～ 221和242～254位氨基酸区域,6种弧菌具有1个共同的抗原表位基序KDG-A-D-S.结论 OmpU蛋白是弧菌属中较为保守的一类功能蛋白,共同的抗原表位基序有望成为检测多种弧菌的靶标和研制多表位疫苗的靶位.     

拟态弧菌OmpU蛋白在草鱼肠组织中互作蛋白的筛选鉴定

【目的】为了确定草鱼肠组织蛋白中能与拟态弧菌OmpU黏附素蛋白发生互作的蛋白。【方法】在前期构建重组表达质粒pET-32a-OmpU基础上,通过IPTG诱导表达及亲和层析纯化获得可溶性His-OmpU融合蛋白,经Western blot分析显示该重组融合蛋白与OmpU多克隆抗体具有良好的反应原性。以His-OmpU融合蛋白为诱饵蛋白,利用His-tag pull down试验筛选草鱼肠组织蛋白中与OmpU黏附素蛋白结合的蛋白,并经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索。【结果】共鉴定出5个体外互作蛋白,分别为α-肌动蛋白2(α-Actin 2)、细丝蛋白A(Filamin A)、α-辅肌动蛋白4(α-Actinin 4)、转胶蛋白2(又称肌动蛋白结合蛋白2,Transgelin-2)和调宁蛋白2(Calponin-2)。【结论】GO功能注释分析显示,这些互作蛋白属于细胞骨架蛋白和细胞骨架调节蛋白,在病原菌的黏附、内化和致病中起着重要作用。研究结果为后期研制黏附拮抗剂和探究拟态弧菌分子致病机理奠定了基础。