巴西固氮螺菌中吸氢酶基因同源性的分子检测

通过TTC(2 ,3,5 氯化三苯基氮唑 )实验筛选出 12株能产生吸氢酶蛋白 (Hup+ )的巴西固氮螺菌 (Azospir rilumbrasilense)菌株。用Qiagen柱分离提纯含豌豆根瘤菌的hup基因片段的质粒 pHVT10 9和pHVT115 ,并用地高辛标记法标记pHVT115 ,与 12株Hup+ 巴西固氮螺菌的总DNA进行斑点杂交 ,结果显示pHVT115所含的吸氢酶基因 (hup基因 )片段与巴西固氮螺菌的大部分菌株的hup基因同源性不强。这一结果表明hup基因在固氮生物中存在着遗传多样性 ,异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。     

嗜温性乳链球菌质粒的分离及其DNA同源性的研究

分离10株嗜温性乳链球菌的质粒,DNA的电泳图表明,不同菌株中有2至9个质粒,其分子量从 2.8到80k6不等。用”p标记已知的质粒pUCL22(55kb）和pUCL22的1.3kb,4.4kb DNA片段分 子探针,分别与被研究的乳链球菌的质粒杂交,放射自显影结果证明,一些菌株的某些质粒与pUCL22 探针和其DNA片段探针有同源性。质粒pUCL22探针检验出菌株L72, D47中的80kb的质粒,该 质粒在电泳图中没有看到。     

紫云英根瘤菌Ra159的巨大质粒上存在有nod和nif基因的证明

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)Ra159中存在有两个分子量分别约为300Md(pRal59a)及大于300Md(pRal59b)的巨大质粒。以肺炎克氏杆菌的固氮酶结构基因nifHDK片段和苜蓿根瘤菌共同结瘤基因nod ABCD片段作探针进行的杂交试验证明了紫云英根瘤菌的大质粒pRal59b上存在有nod基因和nif基因。将这些大质粒转移到nod—nif基因缺失的苜蓿根瘤菌突变株Rm627—1,只有带pRal59b的转移接合子能在紫云英植物上形成根瘤,但这些根瘤均不能还原乙炔。     

毛萼田菁茎瘤菌(Azorhizobium caulinodans)吸氢活性缺陷株的筛选及特性

利用转座子Tn5随机插入突变法,从毛萼田菁茎瘤菌（Azorhizobiumcaulinodans）中筛选得到两株吸氢活性缺陷突变株（Hup-）R－49和R－309,其固氮酶活性也大大降低,约为野生型固氮酶活性的6％～8％。以带有Bradyrhizobiumjaponicum的5．9kb的hup基因的质粒pHR11为探针与A．caulinodansORS571和B.japonicum122DES（Hup＋）的总DNA进行分子杂交,放射自显影表明,A．coulinodans基因组含有与B.japonicum的hup基因同源的DNA片段,将携带B．japonicumhup基因的嵌合质粒pHR11与A.caulinodansHup-突变株进行体内遗传互补,接合转移子吸氢酶活性可以恢复至野生型的60％,同时固氮酶的活性亦有所提高。     

杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒限制图谱

本文报道一株国内分离的具有杀幼蚁活性的球形芽孢杆菌(Bacullus Sphaericus下文简称Bs)的大质粒(pFWl),其分子量为69．5×10⁶道尔顿,绘制了该质粒的xhol限制性核酸内切酶酶图。以苏云金芽孢杆菌以色列变种(Bacillus huringiensis israelensis下文简称BTI)75×10⁶道尔顿质粒为探针与泼菌株DNA进行核酸杂交,结果表明BTI与该菌株为毒素蛋白编码的基因序列之间无同源性,说明它们的进化来源是不相同的。     

华葵根瘤菌nifA基因的克隆和功能分析

华葵根瘤菌(Mesorhizobium huakuii即R.astragali)159的nifA基因的序列分析表明,该基因全长1227bp,编码分子量为44734D的Nif A蛋白。与其它NifA蛋白的序列比较发现,华葵根瘤菌NifA蛋白也存在保守的中间结构域和C末端DNA结合结构域,但其氨基端缺失。Tn5定点突变得到的突变体是Nif-表型。构建了nifA基因组成型表达的质粒,此质粒在大肠杆菌中对华葵根瘤菌nifHlacZ有激活作用。     

六株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学分析

对 6株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学进行了分析 .6株菌与nifHDK基因有杂交 .菌株总DNA经BamHⅠ酶切后与pEA9 DNA进行Southern杂交 ,只有 2株菌具有完整的质粒DNA ,其余菌株质粒DNA发生了 15 3～ 137 7kb不同程度的缺失 .用切割位点较少的限制性内切酶XbaⅠ酶切 6株菌的总DNA ,经脉冲场凝胶电泳 (PFGE)后用pEA9 DNA为探针进行Southern杂交 ,每株菌的pEA9 DNA明显大于用BamHⅠ酶切后的杂交结果 ,表明质粒与染色体发生了整合 .转座子Tn5或插入序列IS 12 2 2和IS 12 71可能参与质粒与染色体的整合过程 .     

浑球红细菌Rhodobacter sphaeroides吸氨酶(hup)基因簇的分离与鉴定

以Rhodobactercapsulatus的hopS’L基因DNA片段为探针,通过Southem杂交,从构建的Rhodobactersphaeroides601基因库中调取hup基因。阳性克隆Cosmid1可与Hup突变株JP91（HupS－）、RCC8（HupR-）以及BSE8（HupT-）互补,而Cosmid3和Cosmid9只能与BSE8互补;试验所产生的接合转移子均恢复了吸氢酶的活性和自养生长能力、将Cosmidl的3．5kbPstⅠ和4．5kbBamHⅠ片段分别亚克隆到pWY11和pWY10中。pWY11和pWY10的部分DNA序列与R．capsulatus中的相关基因具有很高的同源性,从而证明了所得到的Cosmid1确实含有R．sphaeroides的基因簇。     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

Tn5-Mob系统诱导根瘤菌属之间耐盐和共生性状的转移

本实验通过质粒pSUP501l及其辅助质粒RP4将Tn5-Mob随机插入苜蓿根瘤菌(Rhizo-bium meliloti 042B)的基因组中,得到86株接合子SR。随机选取4株SR,通过辅助质粒R68．45的三亲本杂交,将它们的DNA片段引入慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium,japo—nicum USDA 110),获得106株接合子BSR。大部分BSR菌株获得了生长快速的特性和耐盐性,一般能耐0．3—0．5m01／L Nacl,其中有些菌株能产生黑色素。将9o株BSR回接大豆和苜蓿植株,发现47株能在大豆和苜蓿植株结瘤,但在苜蓿卜无固氮活性;26株只能在大豆植株结瘤固氮;13株只能在苜蓿植株结瘤而不固氮;4株在大豆和菖蓿植株均不结瘤。其中,获得了4株耐盐性和固氮酶活性强的接合子。     

粪产碱菌nif H,nif D和部分nif K的克隆、定位及序列分析

提取粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)总DNA,经限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳,以含肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nif H和nif H-D基因的DNA片段为探针进行Southern杂交,筛选出与nif HDK同源的4.6kb片段,克隆到pBluesript SK~+载体上,构建了重组质粒pBZl.经亚克隆、酶切、DNA序列分析后发现,粪产碱菌具有与其它固氮菌相似的结构特征,其nif HDK共用1个启动子,具有上游激活序列UAS,RNA聚合酶σ⁵⁴因子识别序列、1个A-T富集区和SD序列.nifH和nif D的阅读框架分别为888和1476bp,GC含量各为61.6%和60.2%.nifH-nif D和nif D-nif K的基因间隔区长度分别为101和105bp,各存在1个7bp的反向重复和1个SD序列.由阅读框架(ORF)推导的铁蛋白和钼铁蛋白α亚基的氨基酸序列与其它固氮菌相比有较高的同源性,高度保守的氨基酸残基所处的位置也很相似.同源性比较说明,粪产碱菌与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)同源性最高.     

我国葡萄根癌农杆菌Ti质粒的特征

以窄宿主葡萄农杆菌Ag162Ti质粒的T-DNA区tmr、tmsl和ocs基因座位以及T_A-DNA和T_B-DNA片段为探针,对12株我国分离的不同生物型、质粒类型和寄主范围的葡萄根癌农杆菌的引质粒转移DNA(T-DNA)进行Southern杂交分析。在9株生物3型octoplne Ti质粒菌株中,与上述探针均同源。其中窄宿主葡萄根癌农杆菌菌株杂交片段彼此较一致。广宿主葡萄根癌农杆菌菌株的杂交片段彼此差异较大。1株无致瘤能力的生物1型菌株与5个探针均不杂交。1株生物3型nopaline Ti质粒菌株及1株诱导冠瘿瘤中只合成精氨酸的菌株,杂交带的变化也大。由此可见葡萄农杆菌在生物进化过程中其转移DNA呈多态性,成为农杆菌中特殊类群。本分析对葡萄根癌农杆菌致病菌株的鉴定亦有帮助。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆和启动氯霉素抗性基因表达

黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulosis virus简称AsGv)DNA和pPL603质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后,再用T4连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51感受态细胞。然后在loμg／m1氯霉素的sPBY选择平皿上筛选,得到了抗氯霉素的转化子。经过琼脂糖凝胶电泳检测,转化于中的重组质粒比原载体pPL603质粒分子量大。由于重组质粒上的抗性表达水平可达250μg／m1氯霉素,比pPL603质粒抗性表达水平(5μg／m1)提高50倍。所以重组质粒携带了有启动作用的DNA片段。启动功能片段的分子量,经琼脂糖凝胶电泳测定约为O．9kb。除进行DNA—DNA分子杂交确证外,并用重组质粒pAsGVPl5进行了第二次转化、抗性水平测定和分子量分析。     

链霉菌M1033 D－木糖异构酶的分子克隆

链霉菌M1033染色体DNA经BamH Ⅰ酶解后电泳,Southern转移。根据自测的链霉菌M1033 D－木糖异构酶氨基酸序列设计合成寡聚核苷酸探针x－2、x－3,以x－2、x－3及Am－pullariella sp3876 D-木糖异构酶基因(1．17kb)为探针进行杂交,确定与上述探针杂交最强处在15kb左右。从胶上分离出g-20kb大小的片段,克隆到EMBL 3载体中,经杂交筛选后,得到0．6％的阳性噬斑,其插人大小为13kh。将插入DNA的saIⅠ酶解片段(2．5kb)进一步亚克隆于pucl8,得到重组质粒puB l,经酶解图谱、部分序列分析和互补实验确定puBl含有完整的M1033 D-木糖异构酶基因     

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ,actⅢ作探针,从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7．0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉索的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。     

固氮酶结构基因在快生型大豆根瘤菌中的定位

分离纯化了一批我国快生型大豆根癌蘸。测定了它们的固氮酶稀性和寄主专一性,发现相同菌株在不同大豆豆种植株上的结瘤和固氮活性差异甚大。蓑国USDA 191和193似寄主专一性较高,在我们所使用的豆种上结瘤能力很低,固氮活性也不高。对根瘤菌中巨型质粒的数量分布进行了分离分析,表明所有快生型大豆根瘤菌都包含1—3个巨型质粒(分子量范围;30-25Md>。用含有固氮酶结构基因的质粒pSA30作为探针对巨型质粒进行杂交,结果表明即使是快生型大豆根瘤菌,固氮酶结构基因也并不一定定位于巨型质粒上。另外,在若干菌株中发现psA30与二个巨型质粒同时杂交,表明有可能nif HDK或其部分基因的拷贝是分散的。     

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilente)Yu 62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用Kado法只发现一个大质粒,以pABm 1表示,其分子量约为1 20 Md;而用改良的Eckhardt方法,则发现有5个大质粒,分别以p&Bm l、pABm 2、pABm 3、pABm 4和pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md和900 Md,部是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的孩酸杂交技术制备了Biotin-nifHDK探针,并对Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了Southern印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明nifHDK基因定位于染色体上。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

微紫青霉CBHI酶的CBD蛋白编码区在大肠杆菌中的亚克隆及表达

对插入质粒pUC18－181上的微紫青霉（Penicilliumjanthinellum）CBHI酶的cDNA基因进行一系列DNA体外操作,包括进行序列定向缺失,最后将两末端修饰为平端后进行连接使质粒环化。用得到的产生序列定向缺失的重组质粒转化大肠杆菌JM109。利用CBD能吸附到结晶纤维素上的特性,从随机选取的24个缺失转化子中筛选到一株含CBD编码区的转化子JM109（pUC18C）,所表达的CBD融合蛋白分子量为21kD．JM109（pUC18C）所产生的LacZ-CBD融合蛋白可通过对纤维素的吸附-解吸附过程一步纯化。其IPTG诱导的pNPC酶活力为零,表明该菌已不再具有CBHI酶活力。