玉米芯稀酸水解及L-乳酸发酵研究

对玉米芯稀硫酸水解条件及糖化液发酵L-乳酸进行了初步研究。结果表明,玉米芯木聚糖最适水解条件为2%H2SO_4、120℃、30 min、固液比1:10,糖化液还原糖含量可达40.8 g/L,主要成分为木塘。细菌A-19可以利用水解液中的葡萄糖和木糖产酸,最适发酵条件为45℃、pH 6.5,从45℃～51℃、pH 5.5～pH 6.5产量均较高。用未浓缩的水解液发酵24 h,L-乳酸产量为30.6g/L,残糖为1.6 g/L,糖酸转化率为82.6%;用浓缩1倍的水解液发酵48 h,L-乳酸产量为41.4 g/L,残糖4.1g/L,糖酸转化率为68.2%,在发酵48 h后继续补料发酵至72 h(补料液为浓缩3倍的水解液),L-乳酸产量为50.9 g/L,残糖6.3 g/L,糖酸转化率为71.8%。该研究为利用木质纤维素生产L-乳酸奠定了一定基础。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

L-乳酸调控乳酸产生菌产物光学纯度的分析

发酵初期在米根霉菌发酵培养基中添加L-乳酸可以调控发酵产物乳酸的光学纯度。随着L-乳酸添加量的增加,所产L-乳酸的光学纯度随之增加,当L-乳酸的添加量≥1.5g/L时,D-乳酸不再产生。同时,L-乳酸的产量、生物量、糖转化率也随之降低。该调控方法对乳酸菌调控产L-乳酸光学纯度影响不大,对大肠杆菌发酵调控产D-乳酸光学纯度没有效果。     

米根霉乙醇脱氢酶(ADH)突变菌株的诱变选育

米根霉发酵生产L-乳酸过程中,由于丙酮酸在丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶(ADH)催化下生成乙醇,使得丙酮酸向乳酸转化的流量减少。采用亚硝基胍(NTG)诱变米根霉AS3．3462孢子液,诱变剂量为0．15 mg/ mL时,致死率为70%～80%。在含丙烯醇的YPD筛选培养基上筛选获得两株ADH活力降低的突变株mut-1和mut-2,检测突变株mut-1和mut-2的最大ADH活力分别为35．67和43．09U/mL,是原始菌株的41．63%和50．29%。发酵72h后,原始菌株的乙醇与乳酸浓度分别为28．9g/L和40．31g/L,而mut-1和mut-2突变株的乙醇产量分别为4．87g/L和6．56g/L,乳酸产量为54．45g/L和44．07g/L。在相同的发酵条件下,米根霉ADH突变株mut-1和mut-2对还原糖的利用速率高于出发菌株,其生物量积累亦高于出发菌株。     

无载体固定化米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸

通过研究影响米根霉菌丝体形态的培养基因素,初步构建了无载体固定化米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸的工艺条件.研究结果表明,首批次发酵培养基采用120 g/L葡萄糖,3 g/L硝酸铵,K 和Na 浓度比为1:1,发酵72 h后,米根霉菌体形态为均匀的茵丝体小球,直径为1.0 mm～2.0 mm,此时L-乳酸产量可达100.8 g/L,葡萄糖转化率为84%.在此基础上,利用米根霉菌丝体小球重复间歇发酵16批次,每批次发酵24h,此时葡萄糖转化率均高于75%,L-乳酸产量保持在60.0 g/L以上,米根霉菌丝体小球形态保持稳定.     

米根霉利用纯糖和不同预处理玉米秸秆酶解糖生产L-乳酸

通过单因素实验设计,优化米根霉摇瓶发酵产L-乳酸。在此基础上,以蒸气爆破和碱处理玉米秸秆酶解液为混合C源,与纯糖对比,研究不同预处理玉米秸秆混合C源对米根霉发酵产L-乳酸的影响。结果显示:在初始葡萄糖质量浓度100g/L、(NH4)2SO4质量浓度2g/L、接种量6%(体积分数)、转速170r/min、发酵12h后添加30g/LCaCO3的条件下,米根霉发酵产L-乳酸质量浓度为69.15g/L。米根霉发酵不同预处理玉米秸秆酶解混合C源,木糖的存在影响了米根霉的C代谢网络,降低L乳酸的产量。     

pH对米根霉发酵厨余垃圾生产L-乳酸的影响

为了强化厨余垃圾发酵L-乳酸的产量和光学纯度,研究了pH对米根霉AS3.819发酵厨余垃圾生产乳酸及其光学特性的影响。结果表明,在中温条件下(34℃),米根霉生长的最适pH为7,最适发酵条件为8。用米根霉发酵非灭菌的厨余垃圾生产乳酸,发酵液中还原糖浓度低,且呈先升高,后下降到最低的趋势。pH调节到近中性和偏碱性(pH6、7、8)的各组还原糖浓度高于偏酸性组(pH 5和对照组)。控制pH为8时,总乳酸产生速率达1 g/(L·h),L-乳酸是主要的异构体形式,L-乳酸在总乳酸中的比例在整个发酵时间段内都保持在0.75以上,L-乳酸浓度最高达到59.8 g/L,L-乳酸光学纯度可达到0.99。控制pH为8时,可以同时获得高的乳酸产量和光学纯度。     

乳杆菌Lactobacillus sp.lxp发酵高产L-乳酸研究

筛选得到一株乳杆菌Laetobaeillus sp．,进行发酵生产高浓度L-乳酸的研究。考察了种龄、接种量、温度和不同pH调节剂对乳酸发酵的影响。结果表明：最佳种子培养时间为15h;最佳接种量为15％;最适培养温度为42℃;与氨水和氢氧化钠相比,碳酸钙更适于作为发酵过程的pH调节刺;以葡萄糖为碳源,添加豆粕水解液和玉米浆作为辅料,2L罐培养120h,L-乳酸质量浓度可达202 g/L,糖转化率91．3％,L-乳酸占发酵液中总酸含量98％以上。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的发酵优化

为显著提高γ-氨基丁酸的产量,对发酵培养基的装液量、接种量、碳源、氮源、L-谷氨酸（L-Glu）的添加量进行了单因素优化,在单因素基础上进行响应面优化,利用 Plackett-Burman 得出对产γ-氨基丁酸影响最大的因素分别为：葡萄糖、玉米浆、接种量以及发酵时间,用最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域。在此基础上,采用 Box-Behnken 试验设计对培养基组分进行进一步优化,得出4种显著因子葡萄糖、玉米浆、接种量以及发酵时间的最佳结果分别为22．0 g·L－1、15．0 g·L－1、19％和48 h。采用优化培养基后,γ-氨基丁酸的产量可达到12．030 g·L－1,较原始培养基的产量增加了5．602 g·L－1。     

离子注入选育高产L-乳酸的米根霉突变株及其发酵特性研究

通过氮离子注入获得米根霉突变株RQ4012,其利用木糖的能力比出发菌株提高了1.6倍;通过多次传代,证明其具有良好的遗传稳定性。试验测定菌株RQ4012发酵木糖生产L-乳酸的最佳发酵条件:木糖10%,生理盐水浸泡孢子9 h,(NH4)2SO43 g/L,接种量4%,CaCO3添加量6%,装液量20%,温度37℃,转速200 r/min,在此条件下,乳酸产量达到79.51 g/L。对混合糖的发酵进行了探索,结果表明该菌能高效利用混合糖生产L-乳酸,在利用植物纤维素水解液生产L-乳酸上有良好的应用前景。     

氨基酸对于Monascus ruber生物合成Monacolin K影响的研究

在Monacolin K发酵中添加氨基酸后发现较高质量浓度的氨基酸高度抑制了Monacolin K的产量。0.1 g.L-1的D-甲硫氨酸在发酵第4 d添加可以提高产量30%以上,而L-甲硫氨酸则没有此功能,D,L-甲硫氨酸因D-甲硫氨酸的关系也有一定的增产效果。以甲硫氨酸代替蛋白胨作为主要氮源,则抑制了polyketide途径的前期步骤,因此严重抑制了色素及Monacolin K的生产。另外,发现1 g.L-1的L-苯丙氨酸的添加时间越早越有利于Monacolin K的生产,在起始时添加发酵单位可达135.9 mg.L-1,可能是因为L-苯丙氨酸经过脱氨后,可以进入polyketide途径从而促进了Monacolin K的生产。     

L-乳酸发酵的代谢调控育种及发酵影响因素的研究

以嗜热乳杆菌(Lactobacillus Thermophilus ATCC8317)为出发菌,采用乙酸-乙酸钠平板为初筛方法,通过复合诱变乳酸产量提高到原来的3.1倍。培养基碳源为玉米粉糖化液,混合氮源为麦芽粉30g/L、蛋白胨5g/L。根据不同温度下细胞比生长速率及产物比生成速率的变化,确定了分阶段控制温度的策略:即在发酵前16h控制温度48℃、后44h控制温度54℃。L-乳酸产量达到135g/L,乳酸的对糖转化率为95%,平均产酸速率为2.25g/(L.h)。     

营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体,广泛应用于化工、制药及农用化学品工业。能够直接发酵生产丙酮酸的菌种主要有Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ[1],Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ[2],Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ[3],Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ[4],Ａｇａｒｉｃｕ?..     

高糖和氮源对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸发酵的影响

鼠李糖乳杆菌经实验室耐高糖高酸选育,能够在高糖浓度下高效高产L-乳酸。以酵母粉为氮源和生长因子,葡萄糖初始浓度分别为120 g/L和146 g/L,摇瓶培养120h,L-乳酸产量分别为104g/L和117.5g/L,L-乳酸得率分别为86.7%和80.5%。高葡萄糖浓度对菌的生长和乳酸发酵有一定的抑制。增加接种量,在高糖浓度发酵条件下,可以缩短发酵时间,但对增加乳酸产量效果不明显。乳酸浓度对鼠李糖乳杆菌生长和产酸有显著的影响。初始乳酸浓度到达70g/L以上时,鼠李糖乳杆菌基本不生长和产酸,葡萄糖消耗也被抑制。酵母粉是鼠李糖乳杆菌的优良氮源,使用其它被测试的氮源菌体生长和产酸都有一定程度的下降。用廉价的黄豆粉并补充微量维生素液,替代培养基中的酵母粉,可以使产酸浓度和碳源得率得以基本维持。     

THE EFFECT OF TEMPERATURE ON L-LACTIC ACID PRODUCTION AND METABOLITE DISTRIBUTION OF Lactobacillus casei

The effect of temperature on the growth and L-lactic acid production of Lactobacillus casei G-03 was investigated in a 7-L bioreactor. It was found that the maximum specific growth rate (0.27 hr^?1) and L-lactic acid concentration (160.2 g L^?1) were obtained at a temperature of 41°C. Meanwhile, the maximum L-lactic acid yield, productivity, and dry cell weight were up to 94.1%, 4.44 g L^?1 hr^?1, and 4.30 g L^?1, respectively. At lower or higher temperature, the Lactobacillus casei G-03 showed lower acid production and biomass. Moreover, the main metabolite distribution of strain G-03 response to variations in temperatures was studied. The results suggested that temperature has a remarkable effect on metabolite distribution, and the maximum carbon flux toward lactic acid at the pyruvate node was obtained at 41°C, which had the minimum carbon flux toward acetic acid.     

维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用

研究了烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对一株光滑球拟酵母(\%Torulopsis glabrata\%) WSH\|IP303以葡萄糖为碳源、以氯化铵为唯一氮源生产丙酮酸的影响。利用正交试验方法,确证了硫胺素是影响WSH\|IP303生产丙酮酸的最重要因素。在硫胺素浓度一定(0.01～0.015mg/L)的前提下,提高烟酸浓度有助于加快耗糖速度。当烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素的浓度分别为8、0.015、0.4、0.04和01mg/L时,摇瓶发酵48h,丙酮酸产量和产率可分别达到52.4g/L和0525g/g。采用优化的维生素组合方式,进行2.5L罐分批发酵,在初糖浓度120g/L的条件下发酵57.5h,丙酮酸产量和产率分别达到69.4g/L和0593g/g,分别比摇瓶培养的最好结果提高了32.%和13%。     

外源绿原酸缓解黑大豆SB铝毒害的机理研究

该文研究了外源绿原酸(CGA)对Al胁迫下铝敏感型黑大豆SB根生理生化指标以及根中胁迫相关基因表达的变化,探讨外源CGA缓解SB根铝毒害的效果及分子机理。以不同浓度Al和CGA处理SB,筛选出CGA缓解Al毒害的最佳浓度,测定Al含量、抗氧化系统酶活性、14-3-3蛋白与H~+-ATP酶的表达、H~+泵活性。结果表明:低浓度CGA能缓解Al胁迫下黑大豆SB根伸长抑制,并促进侧根数目增加,而高浓度CGA的缓解效果下降;0.01 g·L~(-1) CGA使Al胁迫下SB根尖Al含量与MDA含量下降,促进根系柠檬酸的分泌。RTPCR和Western Bloting分析表明0.01 g·L~(-1) CGA促进Al胁迫下SB根中14-3-3b、14-3-3m、14-3-3k和GHA2基因(质膜H~+-ATP酶)的表达,抑制MATE基因的表达。同时,0.01 g·L~(-1) CGA能促进Al胁迫下质膜H~+-ATP酶蛋白磷酸化水平以及其与14-3-3蛋白结合,且能提高质膜H~+-ATP酶和H~+泵活性。因此推测外源CGA可能通过增加侧根数,增强14-3-3蛋白和质膜H~+-ATP酶基因蛋白表达水平和互作,弥补Al胁迫下MATE表达的抑制,增加柠檬酸的分泌,增强SB对铝毒害的耐受性。     

L-乳酸的发酵生产和聚L-乳酸的化学加工

L-乳酸广泛应用于食品、医药、日化和工业等各个领域。近年来随着石化资源的不断紧缺,众多化学合成的高分子材料的生产受到了限制。以生物质资源为基础的L-乳酸因此被大量用于加工生产成聚L-乳酸等环境友好型生物可降解材料。正是由于L-乳酸需求量的增大,如何高效低成本地生产L-乳酸显得尤为重要。系统综述了L-乳酸生产菌株的选育,用于L-乳酸发酵生产的廉价资源的开发利用,L-乳酸的发酵生产和L-乳酸的分离纯化等方面的研究进展。目前研究的热点和难点正是基于上述四个部分:菌种方面,以可以高效代谢利用廉价底物,且营养需求低的选育目标获得了多个优良的生产菌种,然而具备综合代谢优势的菌种还有待进一步选育;发酵底物方面,已开发利用多种廉价,来源丰富且易于菌种代谢并高效转化成乳酸的底物,但是对这些底物工业规模应用还有待进一步研究;发酵工艺方面,建立了环境友好型,劳动强度低的发酵工艺,然而实际应用中仍然存在成本高的问题;后提取方面,通过选育低营养需求的生产菌种和采用新型发酵工艺有效地简化了后提取过程,但是实际应用方面仍受发酵工艺成本高的制约。最后对聚L-乳酸的化学加工以及聚L-乳酸的生物降解进行了探讨并提出了一些建议。