少花龙葵毛状根的诱导和次生代谢物的产生

研究了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)对少花龙葵（Solanum photeinocarpum)的转化和毛状根的诱导,分析了影响转化的因素,并初步检测了毛状根的生长和次生代谢物的产生。发根农杆菌菌株R1000、R1601分别感染少花龙葵的叶片、茎段,约7d后得到毛状根。菌株R1000感染的外植体的生根率分别为90．2％和50．0％,根诱导频率分别为6．2和4．6;菌体R1601感染的外植体的生根率分别为92．1％和49．2％,根诱导频率分别为6和5．5;对照两周内不出根。冠瘿碱检测证实所得毛状根为转化根。感染在MS＋PP333培养基上生长的矮壮苗叶片,毛状根诱导频率显著提高;用MS液体培养基稀释1倍的菌液感染叶片,转化效率也得到提高。毛状根生长速度快,培养4周后干重增加420倍,总糖苷生物碱和皂甙含量分别为原植株根的31和107倍。     

南美蟛蜞菊毛状根诱导及其离体培养

为了探讨利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和生产次生物质,研究了南美蟛蜞菊Wedelia trilobata(L.)A.S.Hitche毛状根的诱导及其离体培养过程中培养基N源、碳源、磷和钙的消耗变化。结果表明,发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes ATCC15834感染南美蟛蜞菊幼嫩叶片外植体7d后从其叶片切口中脉处产生毛状根。毛状根能在无外源激素的培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因已在南美蟛蜞菊毛状根基因组中插入、整合并得到表达。毛状根液体培养0~7d内处于生长迟滞期、7~21d为快速生长期、21d后进入生长平台期。在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖、硝态氮、PO43?、Ca2+被逐渐吸收和消耗,培养至7d时,蔗糖被消耗近50%;硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量的5.8%;至35d时,蔗糖和硝态氮含量分别约为其起始浓度的3.39%和1.82%。与Ca2+浓度变化不同的是,培养基的无机磷被快速消耗,培养至7d时其浓度约为其起始浓度的1.76%;但培养至35d时培养基中仍残存有占起始浓度约61.3%的Ca2+。该结果为今后利用南美蟛蜞菊毛状根来改良其观赏性状和设计合适的培养基来规模培养生产其次生物质提供了可能性。     

三裂叶野葛毛状根的生长及其培养基营养物质的消耗变化

研究了发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834遗传转化产生的三裂叶野葛（Pueraria phaseoloides）毛状根在液体培养过程中生长及其部分营养物质消耗的关系．结果表明：三裂叶野葛毛状根液体培养0～4d内处于生长迟滞期、8～16d为快速生长期、16d后进入生长平台期．培养基的PO4^2-、硝态氮和铵态氮在毛状根液体培养过程中被逐渐吸收和消耗,培养16d时培养基中的PO4^3-被消耗殆尽,其浓度仅为培养基起始PO4^3-浓度的0．26％;培养基的铵态氮和硝态氮则在培养20d时才消耗殆尽;而培养基中的Ca^2＋浓度在培养过程中逐渐降低．但在培养20d时仍未被完全消耗,其浓度约为起始浓度的30．5％．培养基的pH值随培养时间的延长而不断降低,培养20d后pH值由5．62降低到4．09;而毛状根的颜色也随培养基pH值的降低和培养时间的延长逐渐由白色变成浅黄色和浅褐色．该结果为今后设计合适的培养基以开展野葛毛状根的大规模液体培养来生产葛根素提供了可能性．     

外植体龄和蔗糖浓度对黄瓜子叶产生毛状根的影响

研究了外植体龄和蔗糖浓度对发根农杆菌 R160 1介导黄瓜子叶产生毛状根的影响。结果表明 :以 10 d龄子叶外植体产生毛状根的能力最强 ,外植体的毛状根诱导率为 88.89% ;2 0 d龄子叶外植体的毛状根诱导率比 10 d龄子叶外植体降低 52 .86% ;30 d龄子叶外植体感染发根农杆菌R160 1后不产生毛状根。感染发根农杆菌 R160 1的黄瓜子叶外植体在不加或加 1%蔗糖的 MS培养基上的毛状根诱导率极低 ,子叶外植体逐渐变黄 ,腐烂 ;而培养基中添加 2 % ,3%或 4 %的蔗糖可显著提高子叶外植体的毛状根诱导率。黄瓜毛状根能在无外源植物激素的 MS液体培养基中自主生长。冠瘿碱的高压纸电泳检测表明毛状根已被 Ri T- DNA转化     

培养基磷缺乏对黄瓜毛状根生长、抗氧化酶活性及氮源利用的影响

采用液体培养的方法研究了培养基磷缺乏对黄瓜毛状根生长及其抗氧化酶活性及培养基中氮源和钙利用的影响.结果表明,黄瓜毛状根在完全缺磷的培养基中几乎不能生长;而培养基无机磷缺乏会抑制黄瓜毛状根的生长,且浓度越低,其抑制作用越明显,毛状根变得越纤细而长,侧根数减少且短小.与全磷培养相比,磷缺乏培养基培养的黄瓜毛状根可溶性蛋白含量明显偏低,但其SOD和POD活性则明显升高.与完全缺磷(对照)相比,在培养过程中不同无机磷浓度培养的黄瓜毛状根的SOD和POD活性均比对照低.当黄瓜毛状根在不同磷缺乏浓度的液体培养基中培养时,随着培养时间的延长,培养基的电导率逐步下降,并与培养基起始无机磷浓度成正比;其培养基的铵态氮和硝态氮不断被吸收和利用,培养至15d时,培养基中的铵态氮已绝大部分被消耗完毕,但直至培养30d时培养基的硝态氮仍未被消耗完毕.培养基中无机磷缺乏会降低黄瓜毛状根对培养基硝态氮的吸收和消耗以及抑制黄瓜毛状根对钙的吸收.而适当提高培养基的无机磷浓度可促进黄瓜毛状根对培养基中钙的吸收和消耗.     

香石竹毛状根诱导、离体培养及其植株再生

为了探讨利用发根农杆菌遗传转化所产生的毛状根来创新香石竹种质的可能性,本文采用叶盘法,建立了发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes对香石竹Dianthus caryophyllus L.叶片外植体的遗传转化及其植株再生体系。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染香石竹幼嫩叶片外植体12 d后,从叶片外植体切口中脉处产生白色毛状根,21 d后约90%的叶片外植体产生毛状根。所获得的无菌毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基中快速自主生长。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在香石竹毛状根基因组中整合并得到表达。将毛状根置于MS+6-BA 1.0-3.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L中培养15 d后产生淡黄绿色的疏松愈伤组织。愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L,培养6周后不定芽分化率为100%;平均每个愈伤组织产生30-40个不定芽;将不定芽转至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培养基中10 d后产生不定根,发育成再生植株。再生植株移植于栽培基质中20 d后,成活率达95%以上。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11.8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2.5倍,达1.190 mg/g.dry.wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6.7%。     

三裂叶野葛毛状根的诱导及其固体培养和液体培养

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834感染三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)叶片外植体20 d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。感染35d后,约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的 MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。与固体培养的毛状根相比,在液体培养基中培养的毛状根不仅生长迅速,也不会形成愈伤组织。在无外源生长调节剂的液体MS培养基中培养15d的三裂叶野葛毛状根的鲜重、干重、可溶性总糖含量及细胞内活性氧(ROS)含量分别为固体培养毛状根的1.59倍、1.18倍、5.25倍和1.16倍。     

商陆毛状根的诱导、培养及其扼甙的产生

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601感染商陆叶片外植体1周后,在其切口处产生毛状根,20d后产生毛状根的外植体比例达70%,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生,毛状根能在无激素的MS培养基上自主生长,其呼吸速率比对照根提高85.6%,冠瘿碱检测和PCR扩增结果表明,发根农杆菌RiT-DNA的冠瘿碱合成酶基因及其Ri质粒的rol基因均已在商陆毛状根基因组中得到表达。毛状根中总皂甙含量约为自然根的1.54倍,但其多糖含量则仅为非转化根的70%。     

蔗糖浓度对三裂叶野葛毛状根生长及其次生物质产生的影响

本文研究了蔗糖浓度对发根农杆菌ATCC15834诱导产生的三裂叶野葛毛状根生长及其葛根素和异黄酮类化合物产生的影响以及液体培养基中蔗糖的消耗变化.结果表明毛状根在含5%、4%、3%和2%蔗糖的MS培养基中培养16天后的干重增殖倍数分别为11.7、11.9、10.1和5.9;其中尤以3%的蔗糖浓度最有利于毛状根中异黄酮类化合物及葛根素的积累;培养12天后,毛状根的葛根素含量达到最高,约5.147mg/g DW;而其异黄酮类化合物的含量则在培养16天后达到最高,约27.76mg/g DW.在毛状根液体培养过程中培养基的蔗糖浓度随着毛状根的生长而降低,其消耗速率与毛状根的生长速度及其可溶性总糖含量成正比.毛状根的可溶性总糖含量在培养12天时达到最高,而培养16天后培养基中的蔗糖消耗完毕.     

黄瓜毛状根的诱导及细胞分裂素6-BA对其生长和形态的影响

含农杆碱型Ri质粒pRiA4b的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC15834感染黄瓜子叶外植体5d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处产生。感染10d后,约90%的子叶外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。挑选一无菌黄瓜毛状根系置于含不同浓度6-BA的MS培养基中悬浮培养来探讨细胞分裂素6-BA对黄瓜毛状根生长及其形态变化的影响。结果表明,细胞分裂素6-BA能促进黄瓜毛状根的生长及改变其生长形态。随着培养基中6-BA浓度的升高,黄瓜毛状根变得越来越短而粗,更少分枝。与对照相比,培养基中添加0·1~3·0mg/L6-BA能推迟毛状根最大生长峰的出现,降低其可溶性蛋白含量、SOD和POD酶活性;而黄瓜毛状根的乙烯释放高峰比其最大生长峰和SOD和POD酶活性高峰提前5天,但6-BA处理能降低毛状根的内源乙烯释放量。该结果表明细胞分裂素6-BA可能通过对乙烯生成和释放的调节来影响黄瓜毛状根的生长和形态并延缓毛状根的衰老。     

南方红豆杉毛状根诱导体系的建立及毛状根中 紫杉醇的分离纯化研究

目的:研究发根农杆菌对南方红豆杉转化的转化体系和毛状根中紫杉醇的提取纯化工艺;方法:采用发根农杆菌对南方红豆杉不同外植体进行诱导,并对影响毛状根转化的因素进行分析。采用超临界CO2流体萃取法、硅胶柱色谱法以及高效液相法对毛状根中的紫杉醇进行分离提纯;结果:成功构建了南方红豆杉毛状根诱导体系。其中农杆菌的种类、外植体类型、预培养和共培养时间、培养基中激素浓度均影响毛状根的转化率。毛状根经高压纸电泳检测显示表达冠瘿碱。毛状根中紫杉醇经超临界CO2法提取及硅胶柱色谱法分离提纯,采用高效液相法分析显示其纯度可达到98%。结论:发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇,可作为紫杉醇的主要来源。     

三裂叶野葛毛状根的培养及其葛根素的产生

发根农杆菌ATCC15834感染三裂叶野葛叶片外植体20天后,从其切口叶脉处产生的愈伤组织上产生毛状根。感染35天后约85％的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织。毛状根线粒体膜电势的荧光染色结果表明,液体培养的毛状根细胞线粒体的膜电势比固体培养的毛状根高11．8倍。PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。HPLC测定结果表明,三裂叶野葛毛状根中的葛根素含量约为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的2．5倍,达1．190mg/g．dry．wt;并比多年生葛根生药片的葛根素含量高6．7％。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

烟草毛状根多倍体诱导及其植株再生

为了提高烟草的烟碱含量,采用发根农杆菌遗传转化和人工染色体加倍技术,进行了烟草毛状根及其多倍体诱导、植株再生及其烟碱含量测定。结果表明,发根农杆菌ATCC15834感染烟草叶片外植体8 d后产生白色毛状根,15 d后所有叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒的rol B和rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在烟草毛状根基因组中整合并得到表达。烟草毛状根多倍体诱导的最适条件为0.1%的秋水仙素溶液处理36 h,其多倍体诱导率为64.71%。经秋水仙素加倍的烟草毛状根多倍体植株再生的最适宜培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L。与对照(二倍体非转化植株)相比,烟草二倍体毛状根再生植株的顶端优势减弱,腋芽增多,叶片变窄;而烟草毛状根多倍体再生植株茎更粗,节间变短,叶色更深,叶片的宽度和厚度均较对照明显增大。根尖细胞染色体压片观察证实,所获得的烟草毛状根多倍体再生植株为四倍体,其根尖细胞染色体数约为4n=96。盆栽实验表明,烟草二倍体毛状根植株和多倍体毛状根再生植株比对照植株延迟约21 d开花。GC-MS检测表明,烟草毛状根多倍体再生植株的烟碱含量比对照及二倍体毛状根再生植株显著提高,分别约为对照及二倍体毛状根再生植株的6.90倍和4.57倍。     

农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生

利用野生型发根农杆菌15834菌株感染小冠花15日龄无菌苗子叶和下胚轴切段,建立了高效的发状根培养及其体细胞胚胎发生再生体系。发状根可直接从受伤的外植体表面产生,也能在外植体诱导的愈伤组织上发生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上,转化根能自主生长,表现出典型的发根特征。用适宜浓度的乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液2h,感染预培养2d的子叶获得了最高的转化频率(87.4%)。在附加0.2mgL2,4_D,0.5mgLNAA和0.5mgLKT的MS培养基上,发状根能100%形成胚性愈伤组织,并于含0.5mgLKT,0.2mgLIBA和300mgL脯氨酸的MS培养基上顺序经过体细胞胚胎发育的各个典型时期,转换成完整植株。再生植株除具有发达的侧根外,其它形态特征与未转化植株未见明显的差异,但在获得的5个转化克隆中,其中1个的发状根及其再生植株叶片中有毒物质3_硝基丙酸的含量显著下降,分别为未转化对照的57.68%和58.17%。冠瘿碱纸电泳检测和rolB基因PCR扩增检测均证明农杆菌Ri质粒上的T_DNA已经整合到小冠花转化细胞的基因组中。