Purification of lipase from Aspergillus niger and its characterization analysis

从黑曲霉发酵液中经硫酸铵分级沉淀,Phenyl-Sepharose疏水柱层析,DEAE-Sepharose 4B阴离子交换柱得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数达10倍,回收率50％.对脂肪酶的性质分析表明:该酶分子质量约为35 kDa,最适温度和最适pH分别为37℃和9.5,50℃以下和pH6.0～11.0之间保持稳定,属于碱性脂肪酶.Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+对该酶有激活作用,而Al3+、Fe2+、Fe3+对酶有严重抑制作用.变性剂盐酸胍和脲对其未见显著影响,而SDS强烈抑制其酶活.用不同氨基酸修饰剂对酶进行修饰,其中NBS和PMSF强烈抑制该酶活性,NBSF和DTT在低浓度下对酶活影响不大,2,3-丁二酮在高浓度下影响其活性.外加稳定剂如NaCl、PEG、甘油、山梨醇、海藻酸钠,均可不同程度的延长脂肪酶的半衰期.在一定质量比条件下,该酶有良好的抗蛋白酶性质.     

极端环境脂肪酶菌种库建立及其酶学性质研究

为得到特殊性质的脂肪酶酶种,从来源于极端环境的27份样品定向筛选脂肪酶产生菌,并构建了一个小型的菌种库。其中酵母L112在20℃,pH5．0时酶活为18．60u/ml,属低温酸性酶种。酶学性质研究表明,该酶最适作用温度为25-30℃,最适pH为5.4。在pH4.8,50℃条件下40min保持60%以上酶活。Mg^2 和Ca^2 对酶有激活作用,Zn^2 、Fe^2 、Cu^2 和EDTA有抑制作用。该产酶菌析经中国科学院微生物研究所鉴定为罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii(Kufferath)C.E.Slcinner).     

Aspergillus sp.脂肪酶发酵条件优化及酶学性质的研究

作者为了得到一种热稳定性较好的脂肪酶新酶种,通过研究分离白极端环境的Aspergillus sp．的最佳产酶条件及其所产脂肪酶的酶学性质,得出了该菌产酶的最佳发酵条件为：以1％黄豆饼粉为氮源、0．2％玉米淀粉为碳源,1．5％橄榄油为诱导物,起始pH6．0左右。装量10mL（250mL三角瓶。摇瓶转速180r／min）、发酵时间为96h。在最佳发酵条件下可得最大发酵酶活36U/mL。Aspergillus sp．所产的脂肪酶的酶学性质是：最适pH为9．0,在pH5．0—10．0于20℃下放置24h后,残余酶活仍保持在起始酶活的90％以上;该酶的最适温度为50℃,50℃保温60min后仍保留70％以上的酶活。Aspergillus sp．所产脂肪酶的热稳定性较好。     

产低温脂肪酶菌株Geotrichum candidum ch-3的选育、发酵条件及酶学性质研究

从新疆昌吉市油脂化工厂的含油冻土中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株ch-3,形态鉴定及18SrDNA序列分析表明该菌株为白地霉,命名为Geotrichum candidum ch-3。我们对其生长及产酶情况和酶性质做了初步研究。该菌株的最适生长温度是20℃。玉米浆、豆油可显著促进脂肪酶的产生。粗酶液经双水相萃取和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化后进行酶学性质的研究。该脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃可保持66%的相对酶活性,最适pH值为7.0,对热较敏感,50℃处理20min,剩余酶活为55%,Fe2＋、Cu2＋、Mn2＋以及Ca2＋对酶有较强的激活作用。     

重组定点突变巴曲酶酶学性质研究

目的对重组定点突变巴曲酶的酶学性质进行研究,为开发成临床用药奠定基础。方法测定不同的温度、pH缓冲液和金属离子等条件对重组定点突变巴曲酶活性的影响。结果重组定点突变巴曲酶的最适pH值在6．5～7．5之间。该酶在50℃以下活力保持90％以上,但当温度超过60℃时,该酶已完全失活。Ca^2＋和Na^＋离子对酶的稳定性无明显影响,而Mg^2＋、K^＋、Mn^2＋离子则表现为激活作用,Zn^2、＋Cu^2＋、Fe^2＋、Co^＋离子则表现为明显的抑制作用。结论重组定点突变巴曲酶在中性条件下比较稳定,它不耐高温,金属离子对其活性有一定的影响。     

产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153—1、13—2、30425和西1-1,经形态观察、ITS序列测方法鉴定,30425、153—1鉴定为Trichoderma harzianum,西1-1、13—2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,153—1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为45℃、40℃、20℃、20℃,最适pH为9．5、10．0、7.5、9．5,金属离子对153—1、13—2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中Mn^2＋、Cu^2、Pb^2＋对4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba^2＋对4株菌株的酶活均为不同程度的激活作用。     

烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究

烟管菌Bjerkandera adusta WZFF．W-Y11漆酶粗酶液经过丙酮分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,得到了三种电泳纯的漆酶同工酶,总酶活回收率达到65．5％,其中LacA平均纯化了29．2倍,LacB纯化了5．1倍,LacC纯化了18．5倍;三种同工酶的分子量分别为LacA：68．7kDa、LacB：80．2kDa、LacC：77．2kDa。LacA、LacC氧化愈创木酚的Km,大于氧化ABTS的Km,最适作用温度在45．70℃,最适反应pH3．0-5．5,65℃时LacC比LacA稳定,LacC在pH3．5—6．0稳定,LacA在pH5．0-9．0稳定,A1^3对LacA、LacC的酶活有促进作用,C1、Fe^3＋、Hg^2＋抑制LacA、LacC的酶活,Cu^2＋抑制LacC的酶活,而对LacA的活性没有明显影响。     

嗜热菌Anoxybacillus sp．DL3产蛋白酶条件及其酶学性质研究

目的：对Anoxybacillussp．DL3的产蛋白酶条件及其酶学性质进行研究,为下一步进行蛋白酶基因的克隆、表达提供依据。方法：应用常规方法液体培养细菌,研究温度、pH、培养基中碳源、氮源对菌株产蛋白酶的影响,硫酸铵盐析的方法提取酶液,并采用Folin法测酶活性。用紫外分光光度计在OD680hi／1测吸光值。并对提取的蛋白酶液进行酶的最适温度、pH以及酶的热稳定性和pH稳定性研究,向酶液中添加金属离子和EDTA、PMSF,研究其对酶活性的影响。结果：在培养基初始pH是6．5,培养温度为40℃时菌株产酶酶活性最大;培养基中以乳糖为碳源,酵母膏和硫酸铵为氮源,碳源与氮源的比例为1：2时,酶活最大。酶学性质研究结果显示：该酶的最适反应温度是55℃,最适反应pH是7．0;在50℃保温20min-80min内,酶活力下降幅度较小。60℃保温60min后,仍保持约60％的酶活。70℃保温60min后,残余酶活为30％。该酶在pH为6．0～8．0范围内,相对酶活差别不是很大,下降趋势大致相同。在强碱条件下,相对酶活下降很明显。Fe2＋、Cu2＋和Hg2＋对酶活性有明显的抑制作用;Ca2＋、Mg^2＋、Mn2＋等金属离子对酶活性有明显的促进作用;乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）对酶活性也有一定抑制作用。结论：Anoxybacillussp．DL3所产的蛋白酶为嗜热中性蛋白酶,此酶具有较好的热稳定性和pH耐受性,该菌株具有进一步开发、利用的价值。     

里氏木霉GXC木聚糖酶的研究

研究了里氏木霉GXC产木聚糖酶的条件和酶学性质。结果表明,适宜产酶碳源为乳糖、甘露糖、棉子糖、木聚糖和麸皮,氮源为牛肉膏和酵母膏;产酶的最适初始pH为4．0,30℃培养60h。对以麸皮为碳源的培养液进行纯化的酶特性研究表明,木聚糖酶的最适反应温度为50℃,pH为5．5,该酶在pH5．0－7．0和40℃以下相对稳定。Fe^2 和Mn^2 对木聚糖酶有较大的促进作用,Cu^2 、Fe^2 具有抑制作用。     

链霉菌Str s-2产木聚糖酶的条件及部分性质研究

通过碳氮源对链霉菌Str s-2产胞外木聚糖酶活性的影响,得出其适宜培养基为(g/L)：含半纤维素20,(NH4)2SO4 4．0,KH2PO4 1．0,MgSO4-7H2O 0．5,NaCl 0．3,CaCO3 1．0。用DNS法研究了该酶的性质结果表明其最适pH值为6．5,最适反应温度为55℃;Na^ 、K^ 、Ca^2 、Mg^2 等离子对酶有激活作用,而Zn^2 、Ag^ 、Fe^3 和Cu^2 离子则抑制酶的活性。     

中度嗜盐菌Halobacillus sp. LY5的分离、鉴定及其胞外脂肪酶特性研究

利用吐温平板筛选法,从山西运城盐湖中分离获得一株高产胞外脂肪酶的中度嗜盐菌。通过形态学观察,生理生化特征及16S rRNA序列分析,初步鉴定并命名该菌为Halobacillus sp.LY5。酶学性质研究表明,该脂肪酶可在较宽温度范围内(30℃~90℃)保持高活力;在NaCl浓度为10%的反应缓冲体系(pH值8.0)中,温度为50℃时,酶活性最佳。金属离子除Fe3+外,对酶活性均具有明显的抑制作用;而EDTA和SDS亦可不同程度的抑制酶活性。结果表明LY5所产脂肪酶可能存在某些特殊性质。     

白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

构建了白地霉脂肪酶Ⅰ的基因工程菌,为进一步进行蛋白质工程改造和脂肪酶应用奠定了基础。从新疆昌吉市油脂化工厂含油冻土中分离得到1株低温脂肪酶产生菌-白地霉ch-3。该菌发酵上清液中的脂肪酶最适作用温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活力。应用PCR技术从白地霉ch-3基因组DNA中克隆得到脂肪酶Ⅰ基因lip1,将该基因与原核表达质粒载体pET-22b（＋）连接,构建重组质粒pETl-ip1,转化E.coliBL21（DE3）,酶切鉴定,筛选得到重组菌。十二烷基磺酸钠-聚丙希酰胺（SDS-PAGE）显示重组脂肪酶Ⅰ的相对分子质量约为5.8×10^4,酶活为2.73 U/mL,表明lip1基因的表达产物具有正常的生物学活性。白地霉ch-3脂肪酶Ⅰ基因lip1能够在大肠杆菌中有效地表达。     

Pseudomonas sp. RT-1低温脂肪酶的纯化及酶学特性

Pseudomonas sp. RT-1是从低温环境下分离的低温脂肪酶产生菌,对该菌产生的胞外脂肪酶(PL-1)进行纯化,并对其酶学特性进行初步研究。Pseudomonas sp. RT-1的发酵上清液经60%(NH4)2SO4沉淀、12~14000截留相对分子质量(MWCO)透析袋透析、Sephadex G75分子筛和超滤浓缩后,得到了电泳纯的P-L1。SDS-PAGE电泳估算其表观相对分子质量为4.43×104。对其酶学特性研究表明:PL-1是低温碱性脂肪酶且对有机溶剂的耐受性较好。10~40℃内有较好的催化活性,最适作用温度为18℃;0~50℃该酶的稳定性较好,当温度超过50℃时则容易失活;最适作用pH为10.2,且pH在9~11时较稳定;该酶对有机溶剂的耐受性较好,10mmol/L的Ca2+、K+、Na+和Fe3+对PL1的酶活力有促进作用,其中Ca2+促进作用最大,提高了146.07%,而10mmol/L的Cu2+、Co2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Al3+对酶活力具有不同程度的抑制作用,其中Al3+抑制作用最强,抑制了98.55%;PL-1对C链长度小于或等于12的短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力;1mmol/L的去氧胆酸盐(desoxycholate)和0.01%的Triton X100对酶活力具有提高作用,分别提高了30.74%和11.83%;0.01%的SDS和Tween-80、1mmol/L的EDTA和尿素对酶活都有抑制作用,其中EDTA的抑制作用最大,抑制了80%。     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

产脂肪酶真菌的选育及酶学性质研究

从富含油脂土壤中筛选出一株产碱性脂肪酶酶活达6.40U/mL的真菌菌株,经显微形态及ITS序列分析鉴定为产黄青霉Penicillium chrysogenum,该菌株命名为Penicillium chrysogenum J23。该菌的最佳产酶培养条件为：蔗糖1.0%、蛋白胨2.0%、橄榄油1.0%、MgSO4·7H2O 0.05%、接种量1.0%、初始pH 9.0、摇床转速200r/min、30℃培养48h。其所产脂肪酶的最适反应温度与pH分别为33℃和7.5,在pH6.0－10.0酶具有良好的稳定性,在50℃处理2h仍可保持30%以上的酶活力,50mmol/L的Ca2+、Mg2+、K+分别对酶有较强激活作用,而50mmol/L的Fe2+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Li2+对酶则有不同程度的抑制作用。     

Production, purification, and characterization of lipase from thermophilic and alkaliphilic Bacillus coagulans BTS-3

A thermophilic isolate Bacillus coagulans BTS-3 produced an extracellular alkaline lipase, the production of which was substantially enhanced when the type of carbon source, nitrogen source, and the initial pH of culture medium were consecutively optimized. Lipase activity 1.16 U/ml of culture medium was obtained in 48 h at 55 degrees C and pH 8.5 with refined mustard oil as carbon source and a combination of peptone and yeast extract (1:1) as nitrogen sources. The enzyme was purified 40-fold to homogeneity by ammonium sulfate precipitation and DEAE-Sepharose column chromatography. Its molecular weight was 31 kDa on SDS-PAGE. The enzyme showed maximum activity at 55 degrees C and pH 8.5, and was stable between pH 8.0 and 10.5 and at temperatures up to 70 degrees C. The enzyme was found to be inhibited by Al3+, Co2+, Mn2+, and Zn2+ ions while K+, Fe3+, Hg2+, and Mg2+ ions enhanced the enzyme activity; Na+ ions have no effect on enzyme activity. The purified lipase showed a variable specificity/hydrolytic activity towards various 4-nitrophenyl esters.     

普鲁兰多糖高产菌株Y68葡萄糖基转移酶的纯化及特性研究

运用离子交换层析法和凝胶过滤层析法分离纯化普鲁兰多糖高产菌株Y68胞内葡萄糖基转移酶(简称GTF),并以SDS-PAGE、Native-PAGE对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定,研究其酶学特性。结果表明短梗霉Y68中GTF被分离纯化,纯化酶在SDS-PAGE凝胶电泳上显示分子量50.8 ku单一条带,而在Native-PAGE凝胶电泳上显示分子量350 ku单一条带。纯化酶的最适酶反应pH和最适酶反应温度分别为6.0和40℃,酶对pH十分敏感,稳定性较差,对温度的稳定性则稍好。GTF为金属酶,Na+和K+对酶有激活作用,Ca2+、Mn2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Co2+对酶活性有抑制作用,Hg2+对酶活性的抑制作用说明酶活性中心含有二锍键。EDTA、PMSF、SDS和碘乙酸对GTF活性有很大的抑制作用,而二硫苏糖醇(DTT)对酶活性有保护作用。     

牡丹品种‘胡红’开花和衰老过程中花瓣脂肪酶活性的变化

以牡丹品种‘胡红’为材料,采用改良铜皂法测定了牡丹花发育过程中花瓣脂肪酶活性的变化。结果表明,牡丹花瓣粗脂肪酶作用的最适pH为6．5,最适温度为35℃。OP乳化剂提高酶活性3．5倍,Mg2＋对酶活性没有影响。露色期（I级）脂肪酶活性和游离脂肪酸含量最高,之后各时期酶活性逐渐下降并维持在低水平;而游离脂肪酸含量在盛开期（V级）有一小高峰。     

灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质

采用冻干浓缩、（NH4）2S04盐析、HiTrapphenyl（FF）疏水层析和QSepharose FastFlow离子交换层析对灵芝EIM-40发酵液进行分离纯化,获得纯化漆酶,纯化倍数为14．6,回收率为5．3％。SDS-PAGE银染的结果为单一条带,相对分子质量约为6．53×104。以愈创木酚和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为催化底物进行酶学性质研究,最适pH分别为4．8和4．5,最适温度分别为55和50℃,2种底物在pH4．0。5．0范围内,温度低于50℃时,酶的稳定性都很好。以愈创木酚为底物,Km=645．0umol／L;以ABTS为底物,Km=22．2txmol／L。Cu2＋对该酶起激活作用,Fe2＋、Ca2＋、Ba2＋则完全抑制酶的活性。