烟管菌漆酶的分离纯化及部分酶学性质研究

烟管菌Bjerkandera adusta WZFF．W-Y11漆酶粗酶液经过丙酮分级沉淀、DEAE-Cellulose离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤,得到了三种电泳纯的漆酶同工酶,总酶活回收率达到65．5％,其中LacA平均纯化了29．2倍,LacB纯化了5．1倍,LacC纯化了18．5倍;三种同工酶的分子量分别为LacA：68．7kDa、LacB：80．2kDa、LacC：77．2kDa。LacA、LacC氧化愈创木酚的Km,大于氧化ABTS的Km,最适作用温度在45．70℃,最适反应pH3．0-5．5,65℃时LacC比LacA稳定,LacC在pH3．5—6．0稳定,LacA在pH5．0-9．0稳定,A1^3对LacA、LacC的酶活有促进作用,C1、Fe^3＋、Hg^2＋抑制LacA、LacC的酶活,Cu^2＋抑制LacC的酶活,而对LacA的活性没有明显影响。     

粘质沙雷氏菌H3010发酵型D-乳酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质研究

通过PCR技术从粘质沙雷氏菌H3010基因组DNA中扩增出该D-乳酸脱氢酶基因,连接至pET-28a（＋）表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行了重组表达,优化了酶纯化的条件,并对其酶学性质进行初步研究。结果表明,获得的该酶编码基因全长993bp,编码330个氨基酸,大小为37kDa。经优化表达及纯化条件后重组酶纯度可达90％。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为60℃,最适酶促反应pH为7．5（O．2mol／L磷酸盐缓冲液）,37℃下测得对底物丙酮酸的动力学参数Km=3．39mmol／L,Vmax=6．87mmol／（mg·min）,对辅酶NADH的动力学参数Km=1．43mmol／L,Vmax=1．61mmo]／（mg·min）。为酶法生产D-乳酸及利用代谢工程构建产D-乳酸的基因工程菌打下基础。     

荔枝果皮过氧化物酶的纯化及部分酶学性质研究

经硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose和Sephadex G-75柱层析分离,从荔枝果皮中分离提纯了过氧化物酶(POD),该酶被纯化了12．5倍,产率为1．9％。经SDS-PAGE确定为单一条带。该酶最适反应温度为35℃,对热具有较强的稳定性,经75℃处理30min,酶活性只损失50％。最适pH约为6．5,但在pH4．0—8．0范围内活力仍比较稳定。该酶在25℃和0．05mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)条件下对愈创木酚、邻苯二酚和没食子酸的Km分别是2．75、12．4和12．8mmol／L。二硫苏糖醇和抗坏血酸能完全抑制POD活性,L-半胱氨酸、柠檬酸、FeS04、GSH、SDS和ZnS04对POD活性有一定的抑制作用,而FeCl,和CuSOt对POD则有较好的激活作用。     

极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80℃,最适反应pH为5．0,pH5．8～8．2之间酶的稳定性较好,80℃的半衰期为2h,SDS—PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷（pN/PG）为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol／L,Vmax值为312u／mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。     

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

目的：对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法：经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果：酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7．5,在30-50℃时热稳定性较好;K^＋对该酶有激活作用,而Na^＋、ca^＋、Mg^＋、Mn^＋等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2．11mmol／L,Vmax值为0．84mmol／（min·L）。结论：分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（＋）,构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21（DE3）。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6u／mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4．0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2．8倍和3．45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5．4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4．4。     

丝孢菌Monodictys asperospera (Cooke & Massee) Ellis漆酶的分离纯化及其酶学性质

本研究首次发现Monodictyx asperospera(Cooke&Massee)Ellis具有较好的产漆酶能力.粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素层析及丙烯葡聚糖凝胶S-300层析纯化,纯化倍数为8.1,回收率为5.7%.漆酶分子量约为77kD,最适反应温度为55℃,最适反应pH6.0,以丁香醛连氮为底物时Km为0.163mm0l/L,Vmax为0.194 mmol(L·min),含糖量为18.14%,Cu2+对漆酶有明显抑制作用.     

毁灭柱孢菌中一种人参皂苷Rb1水解酶的纯化及酶学性质研究

通过DEAE-纤维素阴离子交换层析、30％～80％（NH3）2SO3盐析、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析和Mono Q HR5／5阴离子交换层析,从毁灭枉孢菌培养液中部分纯化出一种能够水解人参皂苷Rb,的β-葡萄糖苷酶F-I。F—I具有较好的pH稳定性和热稳定性,在pH4．0～11．0范围内和55℃以下表现出良好的β-葡萄糖苷酶活性,其最适pH为5．0,最适温度为55℃。EDTA、Cu^2＋和Zn^2＋对该酶活性有较强的抑制作用。底物专一性分析表明,F—I能高特异性水解人工合成的底物pNPG,还能水解β-葡萄糖苷键连接的二糖如纤维二糖和龙胆二糖,说明此酶为一种β-葡萄糖苷酶。F—I对人参皂苷Rb1表现了较强的水解活性,而对人参皂苷Rb2和Rc的水解活性较低。该酶水解人参皂苷Rb1的路径为Rb1→Rd→F2→C—K。F—I对人参皂苷Rb1的这种高效水解为稀有人参皂苷的工业制备奠定了基础。     

黑木耳漆酶纯化及部分漆酶特性的研究

黑木耳漆酶研究可为漆酶的进一步分离纯化、基因克隆表达和大规模生产应用奠定基础。对黑木耳"黑29"菌株漆酶粗酶液进行硫酸铵分级沉淀后,通过Native SDS-PAGE电泳检测,存在3种漆酶LacA、LacB、LacC,分子量分别为60,34,19 kD。经硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel柱层析技术分离得一纯化成分LacC,纯化倍数7.60,酶活性回收4.28%。对LacC的pH、温度、金属离子和Km值等部分酶学性质进行研究发现,该酶氧化ABTS的Km值为1.18×10-6mol/L,催化氧化底物ABTS的最适pH为3.8,在pH 3.0~4.6表现出较强的稳定性;最适反应温度为55℃,低于50℃时有较好的热稳定性;金属离子Ag+对漆酶有激活作用,而Fe3+、Mn2+、Co2+则有抑制作用。     

毛壳霉内切菊粉酶的纯化与性质

毛壳霉 (Chaetomiumsp .)C34发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE 纤维素 11离子交换层析、Q SepharoseFastFlow离子交换层析、SephacrylS 2 0 0凝胶过滤、PhenolSepharoseTM HP疏水层析 ,得到电泳纯的内切菊粉酶组分 ,纯化倍数为 30 8倍 ,活力回收率为 7 7%。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 6 6kD。菊粉酶的最适pH为 6 0 ,最适温度为 5 0～ 5 5℃。菊粉酶在 5 0℃以下 ,pH5 0～ 8 0时较稳定。Cu2 完全抑制酶的活性 ,Mn2 、Zn2 、Fe2 、EDTA以及NBS(N bromosuccinimide ,N 溴代丁二酰亚胺 )对该酶有很强的抑制作用。该酶对菊粉有较强底物专一性 ,产物主要为低聚果糖 ,也可作用于蔗糖 ,I S值为 2 0。以菊粉为底物时 ,Km 为 0 199mmol L ,Vmax为 115 μmol (mg·min)。     

白腐真菌漆酶的纯化及性质

液体发酵培养白腐真菌F9,粗酶液经盐析、透析浓缩、葡聚糖G-100柱层析、DEAE-纤维素离子交换层析四步分离纯化,得电泳纯漆酶。经SDS-PAGE法测定酶的相对分子质量约为6×104,酶活回收率达46.47%,纯度提高了18.86倍。F9漆酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.8,在35℃以下、pH 4.8～5.4的范围内稳定性较强。其催化愈创木酚的Km为4.61 mmol/L,vm为6.27 mmol/(L.min)。K+对其有激活作用,而Fe2+、Fe3+对其有明显抑制作用。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液(LM3)中至少分泌3种漆酶同工酶(Lac1、Lac2、Lac3)。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃(pH4.0)以下和pH1.5～5.0(28℃)范围内稳定。金属离子Fe2+、Ag+、Hg2+和Cr3+与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2+和DTT完全抑制酶活,而Cu2+对酶有明显激活作用,Mn2+、Zn2+对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶(1U/mL)处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

Laccase stabilization by covalent binding immobilization on activated polyvinyl alcohol carrier

AIMS: Attempts were made to immobilize laccase from Panus conchatus. METHODS AND RESULTS: The laccase was immobilized on carboxylated polyvinyl alcohol (PVA) activated by N-hydroxysuccinimide (N-HSI) in aqueous solution at different pHs, temperatures, and with different reaction times. An optimum condition for laccase immobilization is at pH 3.2, 40 degrees C and 12 h, respectively. Immobilization of laccase increased optimal pH for reaction with 2, 2'-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-solfonate) (ABTS) and pH stability. Immobilized laccase proved to be reacted consecutively 17 times with only a 50% decrease on activity and be used in removal of 2,4,6-trichlorophenol (TCP). CONCLUSIONS: It was possible to immobilize the laccase on carboxylated polyvinyl alcohol by activation with N-hydroxysuccinimide in HAc-NaAc buffer. The immobilized laccase is both stable and reusable. SIGNIFICANCE IMPACT OF THE STUDY: The results indicate that this immobilized laccase can be used in the removal of poisonous effluent from pulp bleaching mills.     

Purification and characterization of laccase from the white rot fungus Trametes versicolor

Laccase is one of the ligninolytic enzymes of white rot fungus Trametes versicolor 951022, a strain first isolated in Korea. This laccase was purified 209-fold from culture fluid with a yield of 6.2% using ethanol precipitation, DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose, and Sephadex G-100 chromatography. T. versicolor 951022 excretes a single monomeric laccase showing a high specific activity of 91,443 U/mg for 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as a substrate. The enzyme has a molecular mass of approximately 97 kDa as determined by SDS-PAGE, which is larger than those of other laccases reported. It exhibits high enzyme activity over broad pH and temperature ranges with optimum activity at pH 3.0 and a temperature of 50 degrees C. The Km value of the enzyme for substrate ABTS is 12.8 micrometer and its corresponding Vmax value is 8125.4 U/mg. The specific activity and substrate affinity of this laccase are higher than those of other white rot fungi, therefore, it may be potentially useful for industrial purposes.     

一色齿毛菌漆酶的酶学特性及染料脱色研究

染料由于具有复杂的化学结构通常难以降解。本文从白腐菌一色齿毛菌LS0547中纯化出胞外漆酶并用于染料脱色实验。SDS-PAGE结果显示纯化的漆酶分子量大小为63.7kDa。漆酶氧化底物ABTS的最适pH为2.2,最适温度为50℃。叠氮钠可强烈抑制漆酶活性,半胱氨酸和二硫苏糖醇可部分抑制漆酶活性。漆酶氧化ABTS,丁香醛连氮和2,6-二甲氧基苯酚的米氏常数分别为0.217,0.306和0.199mmol/L。粗酶和纯化的漆酶用于不同化学结构的染料的脱色研究,结果表明一色齿毛菌纯化漆酶可快速对RB亮蓝进行脱色,偶氮胭脂红和结晶紫的脱色效果低于RB亮蓝,测试的三种染料均可在没有介体存在的条件下被漆酶脱色,显示出一色齿毛菌漆酶在染料废水处理中的应用前景。     

白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质

对白腐菌W 1产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、分子筛和离子交换层析进行纯化 .用SDS PAGE证明该酶的分子量大约为 6 2 4kD .等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 3 5 .酶反应的最适温度为 5 0℃ ,最适pH值为 4 5 .此酶氧化DMP的Km 值为 3 84× 10 -5mol L .金属离子对酶活的影响很大 ,其中K+ 、Mn2 + 、Ag+ 对酶活有促进作用 ,Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制作用 .酶对部分染料也有一定的脱色效果     

毛栓菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究

对毛栓菌产漆酶的分离、纯化及酶学性质进行研究。粗酶液经硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose柱层析,得到2种漆酶同工酶LacA和LacB。LacA和LacB回收率分别为17.1%和2.74%。SDS-PAGE电泳测得2漆酶的分子量分别为54.6 ku和7.7 ku;LacA和LacB最适作用温度分别为50℃和60℃;最适反应pH值分别为4.5和4.0;Cu2＋、Mg2＋对LacA有激活作用,对LacB影响不大;Ag＋对LacA和LacB表现为完全抑制;Fe3＋对LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2＋、Mn2＋、K＋、Na＋、Zn2＋对LacA和LacB影响不大。DTT、EDTA、DMSO、SDS对酶均有不同程度的抑制作用,且随其浓度的升高抑制作用增强。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。     

毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性的研究

对毛木耳AuriculariapolytrichaAP4的粗酶液进行PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶,并且通过运用NativeSDS-PAGE获得三种漆酶的分子量大小分别约为:LacA(110kD);LacB(84kD);LacC(65kD)。对漆酶粗酶液通过硫酸铵分级沉淀和离子交换柱层析进行纯化,用SDS-PAGE证明获得纯化的单一漆酶LacB。LacB漆酶的反应的最适温度为30℃,最适pH为3.0。此酶氧化ABTS的Km值为6.64×10-mmol/L,金属离子对酶活的影响很大,其中5Ca2+,Mg2+,Zn2+,Na2+,Ag2+对漆酶LacB有明显的激活作用;Co2+,Hg2+,Fe3+,Fe2+,Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。LacB和其它真菌漆酶一样具有底物专一性不强的特点,并且LacB对RB亮兰染料有很好的脱色作用。