关于ISSR反应弥散背景消除方法的几点讨论

目的:讨论消除ISSR反应弥散背景的一些方法。方法:对于不同的反应条件,分别进行梯度试验,包括:退火温度(45℃、47℃、49℃、50℃)、不同引物浓度(0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L)、不同模板浓度(50ng、100ng、200ng)及不同纯度。结果:梯度试验结果如图1~10所示。退火温度47℃,引物浓度0.6μmol/L,模板浓度100ng左右,纯度高的模板,在这些条件下得到的电泳图谱比较清楚。结论:导致弥散背景产生的主要原因有:过低的退火温度;不适当引物浓度;较高的模板浓度;还有模板纯度不高。     

巨型引物PCR法对抗CD3改型单链抗体

亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一.利用巨型引物PCR定点诱变方法,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段,即巨型引物,将其经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,作为3′和5′的两端引物应用于第二轮PCR反应中.通过改变标准PCR反应条件,调整引物与模板的浓度,扩增出特异性较强的目的DNA条带.PCR产物经回收后,进行DNA测序.测序结果表明利用该方法扩增得到特异的抗CD3改型单链抗体的突变体库.     

珍珠黄杨ITS-PCR体系的建立与优化

本研究利用改良CTAB法从珍珠黄杨叶片中提取基因组DNA作为模板,在TaqDNA聚合酶量不变的基础上,利用正交设计L_9(3~4)对4个因素(模板DNA、Mg~(2+)、dNTP和引物)在3个水平上对珍珠黄杨ITS-PCR反应体系进行优化.实验结果表明,在总体积50μL的反应体系中,建立了最佳ITS-PCR扩增条件:Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、引物浓度0.3 μmol/L、dNTP浓度0.3 mmol/L、DNA模板浓度240 ng/50μL、ToqDNA聚合酶的用量1.75 U/50μL和退火温度56℃,该优化体系保证了珍珠黄杨ITS-PCR产物的纯度和质量要求.珍珠黄杨ITS片段克隆测序后获得的序列长度为642 bp,其系统学信息将为珍珠黄杨的起源进化提供有力的分子水平证据.     

孓遗植物桫椤RAPD分析中主要反应参数的影响

为得到桫椤RAPD扩增的最佳条件,对影响桫椤RAPD扩增的模板纯化方法、模板含量、酶浓度、Mg²⁺浓度、dNTP浓度和引物浓度及扩增程序等多种因素进行了探讨.结果表明,用玻璃奶和蛋白酶K纯化后获得的DNA作为模板进行RAPD反应,其扩增带比用未纯化的和仅用无水乙醇再沉淀的DNA为模板更亮,更清晰,重复性更好;模板浓度、酶浓度、Mg²⁺及dNIT浓度、引物浓度及退火温度这些因素都会对RAPD产生影响.经过本实验的探索,发现桫椤RAPD扩增的最佳体系是(2.5×10^-2mL反应体积):模板浓度为70ng,Mg²⁺浓度为2.5mmol·L^-1,dNTP为0.2mmol·L^-1,引物3×10^-4mL;最佳扩增程序为:94℃200s,一个循环;94℃60s,36℃60s,72℃120s,40个循环:72℃600s,一个循环:4℃保存.     

快捷的定点突变效率近100%的大引物PCR方法

报道了一种新的PCR突变方法,它不需要纯化大引物或设计特别的旁侧引物．利用一个诱变引物和两个测序引物(T_m≤58℃)作为旁侧引物．第一轮PCR产物12.5 μl直接加入到50 μl的第二轮PCR反应体系作为模板和大引物,在开始第二轮PCR反应时,增加在68℃退火温度下进行10个循环的不对称PCR,这一步骤大大提高了通过600 bp或800 bp大引物所导致的突变效率．结果表明,该方法的产物能够达到高保真、97%～98%的突变效率和高产率．     

应用ABI PRISMTM310测序仪进行快速且经济的DNA测序

目的 使DNA测序更快速且经济。方法 根据测序模板的不同采取相应的测序方法。视具体情况调整测序反应条件,改进仪器的操作方法,减少测序反应体系及合理使用试剂,结果 对测序模板,测序条件和仪器操作的优化,可缩短测序时间,充分利用试剂,可降低测序成本。结论 在保证测序质量的前提下,不仅快速而且经济。     

在单个PCR管内快捷完成定点突变

采用大引物方法,利用质粒多克隆位点两侧的普通测序引物作为旁侧引物,在单个PCR管内,经2个步骤共34个循环进行定点突变. 该方法通过优化模板和引物的量达到降低PCR循环次数, 通过加入10个在68℃复性条件下的PCR循环达到增加突变效率而无需胶纯化.本方法达到平均62%的突变效率,而且全长扩增产物的产率很高.     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计L9(34)对影响葡萄ISSR-PCR反应体系的4个因素(dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA)在3个浓度水平上进行试验,并通过直观分析初步确定其反应体系;在此基础上,通过单因素试验探讨了dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄ISSR-PCR扩增结果的影响,确定最佳反应水平。最终建立了葡萄ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:在25μL的反应体系中,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量0.5 U,引物浓度0.4mmol/L,DNA模板用量40 ng。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min 30 s,40次循环;最后72℃延伸10 min,10℃保存。     

随机扩增多态DNA规范化反应体系的探讨

在研究猪分子标记遗传距离同杂种优势的关系时 ,对模板浓度和纯度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2 +浓度、不同商标的Tag酶等影响RAPD扩增的因素进行了系统的分析 ,在此基础上建立了适宜于本实验室研究的最佳RAPD技术体系 :2 5 μl反应体系中 ,含 10×buffer 2 .5 μl,MgCl2 1.75mmol/L ,dNTP 0 .2 5mmol/L ,引物 0 .2 4μmol/L ,Tag酶 2U ,模板 5 0～ 10 0 μg ,1μg/μlBSA。反应程序为 :94℃预变性 5min ,然后 94℃变性 1min ,36℃退火1min ,72℃延伸 2min4 0个循环 ,最后在 72℃延伸 10min。     

用任意引物PCR进行基因多态性分析时最佳反应条件的建立

用任意引物进行基因组指纹分析是检测DNA多态性的一种通用方法,对遗传学图谱绘制、系统发育学和种群生物学都很有用.由于任意引物PCR(AP-PCR)影响因素很多,获得理想的指纹扩增图谱比较困难,有必要寻找一种简单有效的方法建立最佳扩增体系.对Mg²⁺浓度,模板浓度、引物浓度等三个因素进行优化选择AP-PCR扩增反应实验研究.实验结果表明：Ap-PCR反应的最佳反应条件为2 mmol/L MgCl₂,50 ng的DNA模板及0.3 μmol/L的引物浓度,在上述条件下获得的AP-PCR产物最丰富,条带清晰.