共聚焦显微术测定大鼠和黄鼠心肌细胞游离Ca2+浓度与温度的关系

运用共聚焦激光扫描显微成像术对比研究非冬眠动物大鼠和冬眠动物黄鼠心肌细胞胞内Ca2+浓度 ([Ca2+]i) 随温度的变化.首先标定了不同温度下Ca2+探针indo-1的解离常数,提出并证明按α定态设定标定溶液pH值的必要性.细胞荧光分析显示,大鼠心肌细胞[Ca2+]i随温度降低显著上升,低温下频繁出现自发钙波,胞内发生钙超载;相比较冬眠动物黄鼠心肌细胞[Ca2+]i在相同条件下保持稳定,避免发生钙超载.认识其中的钙稳态机制可能对有关医学问题有潜在的指导意义.     

用Fura－2双波长荧光法测定神经细胞内游离钙

采用新型Ca²⁺荧光指示剂Fura-2建立双波长荧光法测定分离的大鼠神经细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i).结果显示,在静息状态下,其[Ca²⁺]_i为109±12nmol/L.30mmol/L KCl可显著增加[Ca²⁺]_i,并且KCl的这种效应呈一定的剂量依赖关系,提示该法灵敏、可靠.     

脉冲电场对粒细胞内Ca2+浓度影响的动态变化

利用激光共聚焦扫描显微镜和装有CCD系统的荧光显微镜 ,研究在单脉冲电场作用下经fluo 3/AM标记的鸡胚小脑粒细胞内自由Ca²⁺浓度 ( [Ca ²⁺]_i)的动态变化过程 .结果表明 :在单个电脉冲作用下 ,细胞内Ca²⁺浓度立刻升高并达到其最大值 .Ca²⁺浓度升高的幅度以及升高的速率具有电场强度的依赖性 .当细胞外Ca²⁺被过量的EGTA络合或细胞膜上的Ca²⁺通道被La ³⁺堵塞后 ,细胞内的Ca²⁺浓度仍然升高 .细胞内不同区域的Ca²⁺浓度同时升高 ;两极内的Ca²⁺浓度早于胞体的Ca²⁺浓度达到最大值并迅速恢复 .     

河豚毒素和Cd2+对Zn2+诱发爆发波放电的影响

本文用微电极细胞内电位记录、通道阻断剂和放射性同位素等技术发现,锌离子可诱发爆发波放电(BD),钠通道阻断剂——河豚毒素对BD无效应,而钙通道阻断剂——Ca²⁺则可使BD消失,Cd²⁺可使[⁶⁵Zn²⁺]_i量减少。以上结果说明,Zn²⁺诱发BD的产生机理很可能是Zn²⁺代替Ca²⁺通过钙通道进入胞内引起的。     

硒对NO诱导的内皮细胞内游离钙离子浓度变化的影响

用Fura-2显微荧光测钙技术,研究了用外源性一氧化氮（NO）供体S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）诱导的,人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞胞内游离钙离子浓度（［Ca²⁺］_i ）升高以及硒的抑制效应.结果表明,GSNO作用于ECV-304细胞,短时间内即可导致其胞内游离钙离子浓度升高.胞外液换为无钙液或向胞外液中加入CdCl₂（1 mmol/L）对GSNO引起的［Ca²⁺］_i升高无影响.提示,GSNO刺激主要引起胞内钙库释放.而且,一氧化氮清除剂血红蛋白（Hb）对这一过程有抑制作用,说明GSNO引起的胞内钙库释放由NO介导.经亚硒酸钠（1 μmol/L）处理的细胞,其NO引起的［Ca²⁺］_i升高幅度明显被抑制,说明NO的这种作用可能与细胞的氧化还原状态有关.     

肺腺癌A549/DDP细胞周期变化及其多药耐药性

用Fura-2/AM标记药物敏感的肺腺癌细胞A₅₄₉和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A₅₄₉/DDP两种细胞胞内游离Ca²⁺,用碘化丙锭(PI)标记细胞DNA,检测其胞内Ca²⁺的变化及两种细胞增殖能力和细胞周期.实验结果表明,抗药性细胞株A₅₄₉/DDP胞浆内游离Ca²⁺的浓度仅为药物敏感细胞株A₅₄₉的1/3左右,同时前者的细胞增殖能力较后者明显增强,而且细胞周期也明显缩短.当用BAPTA-AM和EGTA或A₂₃₁₈₇和Thapsigargin处理细胞以降低或升高其胞内自由Ca²⁺浓度时可改变细胞的生长周期,二者也呈现明显差别.这些结果表明,对顺铂产生耐药性的人肺腺癌A₅₄₉/DDP细胞胞内Ca²⁺浓度的降低,可能影响细胞的增殖,缩短细胞的生长周期,特别是影响起决定作用的G1期,从而有利于肿瘤细胞多药耐药特性的维持.     

Peculiarities of phospholipase C-dependent release of CA2+ from intracellular stores upon activation of choline and purine receptors in myocytes of the guinea-pig small intestine

Using a two-wave fluorescence probe, Fura-2, we studied changes in the intracellular concentration of calcium ions ([Ca²⁺]_i) resulting from activation of muscarinic and purine receptors in single myocytes of the guinea-pig small intestine. Applications of the respective agonists added to the normal Krebs solution (1.0, 10.0, and 100.0 μM carbachol, CCh, as well as 10.0 and 100.0 μM ATP) induced a rise in the [Ca²⁺]_i. Carbachol evoked an increase in the [Ca²⁺]_i, including two components (a rapid and a plateaulike), while ATP under analogous conditions led only to a short-lasting rise in the [Ca²⁺]_i. Transients induced by CCh or ATP applied in different concentrations, which exceeded a certain level, did not significantly differ from each other in their amplitudes, i.e., they were generated according to an all-or-none principle. In the nominally Ca-and Mg-free solution, CCh and ATP induced only rapid increases in the [Ca²⁺]_i in myocytes. The absence of the slow component in the [Ca²⁺]_i elevation upon the action of CCh under such conditions indicates that the effect of ATP, as compared with that of CCh, is not related to activation of the entry of Ca²⁺ ions into cells through voltage-operated calcium channels. After the addition of CCh, repeated application of CCh or ATP induced no effect, while application of CCh after the addition of ATP initiated a rise in the [Ca²⁺]_i. These data show that intracellular calcium stores are depleted completely upon the action of CCh, while they are depleted only partially after the action of ATP. An inhibitor of phospholipase C (PLC), U-73122 (5.0 μM), completely blocked rises in the [Ca²⁺]_i induced by both CCh and ATP; therefore, the release of Ca²⁺ ions from the intracellular calcium stores after application of these agonists is mediated by PLC. We hypothesize that the difference in the release of Ca²⁺ ions from the intracellular stores observed in our experiments upon activation of choline and purine receptors (partial and complete depletion of the stores upon the action of ATP and CCh, respectively) is responsible for the opposite functional effects of the above-mentioned neurotransmitters on smooth muscles. Neirofiziologiya/Neurophysiology, Vol. 38, No. 1, pp. 3–10, January–February, 2006.     

亚硒酸钠对巨噬细胞内游离Ca2+和Mg2+的影响

用单细胞阳离子测定系统研究了SeO^2-₃对巨噬细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的影响.实验结果表明:SeO^2-₃高于10^-4mol/L时,有显著的细胞毒性.SeO^2-₃对细胞的毒性作用使细胞内游离Ca²⁺和Mg²⁺的浓度升高但Ca²⁺浓度的升高速率比Mg²⁺快.还有,高于10^-4mol/L的SeO^2-₃对红细胞膜上的Ca²⁺-ATP酶活性有明显抑制作用.     

胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

人白细胞抗原-G1对NK92效靶识别过程的影响

人白细胞抗原G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)属非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ类分子,为自然杀伤细胞（natural killer,NK）抑制性受体的识别配体,可以向NK细胞传递抑制性信号,从而抑制NK细胞的细胞毒作用.为了研究HLA-G对NK与靶细胞识别作用的影响机制,采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术对全长HLA-G1的表达和功能进行了探讨,并对效靶识别过程中靶细胞［Ca²⁺］_i（胞内自由钙离子浓度）进行了实时检测.结果发现,全长的HLA-G1表达于K562、JAR和CHO细胞的胞浆和胞膜上,它能够部分地抑制NK92的细胞毒作用. NK92与CHO和GFP-CHO细胞作用后,靶细胞［Ca²⁺］_i出现了明显的升高,HLA-G1的表达则抑制了靶细胞［Ca²⁺］_i的升高.结果提示：靶细胞［Ca²⁺］_i的升高是有效的细胞杀伤作用的必要条件,HLA-G的免疫抑制功能可能与靶细胞胞内钙离子浓度升高的抑制作用有密切关系.     

离体缺血再灌注鼠心肌钙离子的变化

用液体闪烁计数法测定离体再灌注鼠心肌肌质网(SR)和线粒体(Mit)内 ⁴⁵Ca²⁺放射性强度(cpm),比较能量制剂ATP-MgCl₂,活性氧自由基清除剂SOD和钙阻滞剂Verapamil对离体缺血再灌注鼠心肌细胞SR和Mit钙离子浓度的影响.结果表明,SR内ATp-MgCl₂,SOD和Verapamil组 ⁴⁵Ca²⁺的cpm均高于对照组(P<0.0l或P<0.05),而Mit内均低于对照组(P<0.01).此三种药均能提高离体大鼠心肌细胞内SR ⁴⁵Ca²⁺和降低Mit ⁴⁵Ca²⁺积聚,从而保护了心肌细胞,防止缺血再灌注损伤.     

脱硫废弃物对碱胁迫下油葵幼叶细胞钙分布及Ca2+-ATPase活性的影响

利用脱硫废弃物改良盐碱地对于确保国家粮食安全和生态安全,发展循环经济具有重要意义。为了探索脱硫废弃物提高植物抗盐碱机理,采用盆栽试验法, 研究了施入不同量脱硫废弃物和CaSO₄对碱胁迫下油葵叶片细胞钙分布、总钙含量以及质膜和液泡膜Ca²⁺-ATPase活性的影响。结果表明:在碱胁迫下(CK),Ca²⁺与焦锑酸钾结合成黑色颗粒成团零星分布于叶绿体和液泡中,叶绿体超微结构受到不同程度的破坏。施入脱硫废弃物和CaSO₄,叶绿体结构完整,细胞间隙、细胞壁和液泡中的钙颗粒逐渐增多,同时,质膜和液泡膜Ca²⁺-ATPase活性随脱硫废弃物和纯品硫酸钙施量的增加而增加,其中液泡膜Ca²⁺-ATPase活性无论是对照(CK)还是处理的活性均高于质膜Ca²⁺-ATPase活性。叶片细胞内总钙含量也随脱硫废弃物和CaSO₄施用量的增加呈升高趋势。说明脱硫废弃物和CaSO₄通过增加Ca²⁺-ATPase活性,有利于钙通过质膜和液泡膜进入细胞内,维持膜结构的稳定性,缓解碱对油葵的胁迫。     

双光子及共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用机制

天花粉蛋白(trichosanthin, TCS)是从中草药栝楼根中提取的一种核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤和抗HIV功能.应用双光子及共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针Hoechst 33342、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯 (DCFH-DA)、Indo-1和Fluo 3-AM,首次同时观察了TCS诱导人绒癌细胞（JAR细胞）凋亡过程中活性氧自由基（ROS）和细胞内钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）的变化,实验结果表明TCS引起的［Ca²⁺］_i升高和ROS形成参与了TCS诱导的JAR细胞凋亡,并且ROS形成和［Ca²⁺］_i升高有关.共聚焦激光扫描显微术的研究结果表明,［Ca²⁺］_i升高不是导致ROS形成的主要原因,TCS诱导产生的ROS可能是通过TCS与JAR细胞膜表面受体作用介导的.     

大鼠前脂细胞质膜Na+/H+交换同时参与细胞的增殖和分化

以原代培养的大鼠前脂细胞为模型 ,以 2′ ,7′ bis ( 2 carboxyethyl) 5 ( 6 ) carboxyfluorescein (BCECF)作为检测胞内pH(pHi)的荧光探针 ,测定不同生长因子刺激下胞内pH的变化 ,证明大鼠肾周前脂细胞质膜存在Na⁺/H⁺交换活性 ,胎牛血清(FCS)能快速激活Na⁺/H⁺交换 ,导致pHi升高 (约 0 .2pH单位 ) ,并引起DNA合成 .Ethyl isopropyl amiloride (EIPA)抑制Na⁺/H⁺交换与DNA合成 .在无血清条件下 ,胰岛素不刺激DNA合成但引起细胞分化 ,表现为胞内脂滴积累和 3 磷酸 甘油脱氢酶(G₃ PDH酶 )活性增强 ,同时激活Na⁺/H⁺交换活性导致pHi升高 ;EIPA既抑制胰岛素对Na⁺/H⁺交换的激活 ,也抑制G₃ PDH酶活性增强 .结果证明 :Na⁺/H⁺交换的激活不仅与大鼠前脂细胞增殖相关 ,同时也是细胞分化的早期事件 .     

Cr3+和Cd2+对普通小球藻生长及抗氧化酶活性的影响

[目的] 为探究重金属对淡水绿藻生长的影响。[方法] 选取对水质检测具有明显指示作用的普通小球藻（Chlorella vulgaris）为实验材料,CdCl₂·2H₂O和CrCl₃·7H₂O提供重金属离子,探究不同浓度Cr³⁺和Cd²⁺在单一和复合胁迫下对藻细胞浓度、叶绿素a及相关抗氧化酶活性的影响。[结果] 随着Cr³⁺和Cd²⁺浓度不断增加,藻细胞浓度呈先增长后下降趋势;叶绿素a含量呈现先下降后升高再下降的现象,浓度为1 mg/L的单一和复合胁迫下有最大值,且毒性作用表现为Cr³⁺ < Cd²⁺ < Cr³⁺+Cd²⁺;与藻细胞膜相关的丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量随着重金属离子浓度的增大而增长;重金属离子浓度低于10 mg/L时对藻细胞内抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）表现为促进作用,而大于10 mg/L时具有抑制作用。[结论] 结果表明在单一或复合重金属胁迫下,普通小球藻会充分调动与抗逆性相关的酶来维持自身的正常生长。     

豚鼠精子质膜Ca2+ -ATPase活性与精子顶体反应关系的研究

用生化测定法首次证实豚鼠精子质膜Ca²⁺-ATPase活性在精子获能和顶体反应过程中显著下降.Ca²⁺-ATPase抑制剂利尿酸(ethacrynic acid)抑制质膜Ca²⁺-ATPase活性,但钙调素(50μg/mL)的拮抗剂三氟拉嗪(TFP,200～500μmol/L)对该酶活性没有影响,说明钙调素不直接参与精子依赖于ATP的Ca²⁺的主动泵出.但钙调素与精子的Ca²⁺内流有关,钙调素拮抗剂TFP显著促进精子顶体反应和精子对Ca²⁺的摄入.Ca²⁺-ATPase抑制剂栎皮酮(quercetin)、原钒酸钠(sodiumorthovandate)、利尿磺胺(furosemide)和利尿酸均显著促进豚鼠精子的顶体反应,但却抑制精子对Ca²⁺的摄入,这无法用它们对质膜Ca²⁺-ATPase活性的抑制作用解释.推测这可能是由于Ca²⁺-ATPase抑制剂在抑制质膜Ca²⁺-ATPase活性的同时也抑制了顶体外膜或线粒体外膜上的该酶的活性,导致Ca²⁺在细胞质内的积累,进而通过负反馈机制抑制Ca²⁺进一步内流所致.另外,Ca²⁺-ATPase抑制剂对糖酵解的抑制作用也可能是Ca²⁺在细胞质中积累和抑制精子Ca²⁺摄入的原因.     

异搏定拮抗α-石英细胞毒性作用的研究

借助于单细胞阳离子测定系统等手段,研究了不同细胞外钙浓度下异搏定作用后,细胞存活率与细胞内游离钙浓度(［Ca²⁺］_i)的变化关系.同时还研究了异搏定对实验性硅肺大鼠模型的作用.结果表明：由α-石英引起的肺泡巨噬细胞内钙升高是由于大量细胞外钙内流,造成细胞内钙超载,引起细胞死亡,并进一步导致硅肺形成.异搏定可以抑制细胞内钙增加,降低细胞的死亡.动物模型实验结果还表明异搏定对硅肺的发生有明显的抑制作用.提示异搏定可能成为硅肺的防治药物.     

大鼠背根神经节神经元上失活 BK 通道特性的研究

大电导的电压和 Ca²⁺ 激活的 K⁺ 通道 (BK 通道 ) 在哺乳动物的组织中广泛表达,起着多种多样的作用 . 目前只有少数组织中 BK 通道的性质被深入地研究,而且鲜见有失活的 BK 通道 (BK_i) 的报道,尤其是在神经元中 . 发现在大鼠小直径的背根神经节 (DRG) 神经元中,普遍存在失活的 BK 通道 . 失活的 BK 电流成分是 Ca²⁺敏感的,可以被大电导的 BK 通道特异阻断剂 ChTX 所阻断,而且木瓜蛋白酶可以从胞外改变通道失活的特性 .     

大鼠海马CA1区锥体细胞上一种Ca2+依赖性KATP通道

K_ATP通道在细胞的新陈代谢与膜兴奋性的耦联中起重要作用.采用膜片钳的内面向外式记录方法,在成年大鼠海马CA1区锥体细胞上记录到一种被胞浆侧ATP和甲糖宁（tolbutamide,一种K_ATP通道阻断剂）抑制的Ca²⁺依赖性钾离子通道.在细胞膜内外的K⁺浓度均为140 mmol/L时,通道的电导为(204±21) pS,翻转电位为(3.57±1.13) mV,通道无整流性.通道开放概率及ATP对通道的抑制作用均呈现电压依赖性.该K_ATP通道与以往报道的“经典”K_ATP通道有显著不同,其活动受膜电位、胞内Ca²⁺和ATP三重调节,表明这是一种新型的K_ATP通道.上述结果表明在海马神经元上至少有两种性质不同的K_ATP通道,提示神经元可能通过不同性质的K_ATP通道感受细胞内的代谢状态,进而调节细胞膜的兴奋性.     

川楝素对K+、Ca2+通道活动及细胞内Ca2+浓度的调控

川楝素是我国学者从驱蛔中药中分离、鉴定的一个三萜化合物，已证明具选择地影响神经递质释放，有效地对抗肉毒中毒，促进细胞分化、凋亡，抑制肿瘤增殖，抑制昆虫发育和取食，影响K⁺、Ca²⁺通道活动等多种生物效应. 综述了证明川楝素抑制多种K⁺通道，选择地易化L型Ca²⁺通道和进而升高胞内Ca⁺浓度的研究资料，并对川楝素产生这些生物效应的机制进行了讨论.