杜仲叶片不同发育时期数字基因表达谱分析

为在转录水平解析杜仲叶片发育过程中的基因表达模式,该研究通过数字基因表达谱技术对‘华仲6号’杜仲叶片从展叶(4月)到落叶(10月)不同发育时期的基因表达水平进行比较分析,共获得差异基因3 002个,其中1 764个表达量上调,1 238个下调,这些差异表达基因主要行使催化、氧化还原等功能,参与代谢过程和生物过程等;进一步Pathway富集分析发现,苯丙素类生物合成途径相关基因被富集,其中调控绿原酸合成的6个基因差异表达显著;对这些基因表达模式进行分析显示,4月中旬和9月中旬基因的表达量较高,暗示这两个时期对于绿原酸的合成具有重要作用。荧光定量RT-PCR检测6个绿原酸合成相关基因和12个随机选择的差异表达基因,验证结果显示表达谱测序结果可靠。该研究结果为揭示杜仲叶片在不同发育时期的分子调控机制奠定了基础,并为深入解析杜仲绿原酸合成机理,进而通过分子育种手段提高杜仲绿原酸含量提供新的路径。     

刺五加HMGR基因的表达及其对皂苷合成的影响

以actin为内参基因,采用Real time PCR法分析产地、发育时期、器官以及茉莉酸甲酯(MeJA)对刺五加HMGR基因表达的影响,并采用分光光度法测定皂苷含量,利用SPSS 17.0软件分析两者的相关性。结果表明:HMGR基因在各器官中均有表达,相对表达量间差异较明显(p0.05)。刺五加HMGR基因在盛花期表达量最大,叶片衰老期表达量最低。Me JA处理后显著提升了萌芽期至盛花期HMGR的表达量,而对果实快速生长期之后的影响较小。不同产地刺五加的HMGR基因表达量和总皂苷含量差异显著,而HMGR基因的表达量与总皂苷含量同升同降,存在极显著的正相关关系(p0.01)。     

杜仲含胶细胞的形态学研究

通过变性处理、整体透明及离析等方法的综合运用,可见杜仲体内含胶细胞是一种细长、两端膨大的单细胞,含胶细胞的分枝比较常见,大多为二叉状分枝,罕见三叉状分枝。整体透明后可见含胶细胞在叶片和果皮中的分布状况,同时对含胶细胞的形态学指标进行了测量。     

杜仲含胶细胞的形态学研究

通过变性处理、整体透明及离析等方法的综合运用,可见杜仲体内含胶细胞是一种细长、两端膨大的单细胞,含胶细胞的分枝比较常见,大多为二叉状分枝,罕见三叉状分枝。整体透明后可见含胶细胞在叶片和果皮中的分布状况,同时对含胶细胞的形态学指标进行了测量。     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

杜仲MVA和MEP途径相关基因的亚细胞定位与表达分析

通过对杜仲基因组分析,筛选并克隆出MVA途径和MEP途径的相关基因全长（EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS,EuACOT,EuHMGS和EuHMGR）,并通过生物信息学方法分析其结构特征,结果表明上述基因与其他已知物种相应基因的相似度达73%~85%。通过构建亚细胞定位表达载体,并瞬时转化烟草下表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察显示,EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS基因编码蛋白定位于叶绿体,EuACOT和EuHMGR基因编码蛋白定位于内质网,EuHMGS基因编码蛋白定位于细胞质膜。利用转录组测序技术分析上述基因的时空表达特性表明,MEP途径相关基因在杜仲叶片中大量表达,而MVA途径相关基因在杜仲幼果中大量表达,且杜仲幼果比叶片中的橡胶含量高,因此,推断MVA途径在杜仲橡胶合成中占主导作用。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2 160 bp,包含一个1 758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示TmiHMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。     

杜仲胶合成相关基因EuREF 1的克隆及分析

根据本实验室已建立的杜仲转录组数据库提供的序列信息设计引物,以杜仲含胶组织叶和皮为材料提取总m RNA,采用RACE技术克隆了5'端700 bp和3'端600 bp c DNA片段,连接至p GEM-T载体,经测序拼接后获得全长1 075 bp的杜仲橡胶延长因子基因(Eucommia ulmoides rubber elongation factor 1,Eu REF 1)c DNA序列,其中开放阅读框678 bp,共编码225个氨基酸残基。在NCBI中blastp比对,Eu REF 1与葡萄、蓖麻REF序列同源性分别为42%和41%;预测的蛋白质Eu REF 1氨基酸序列经blastp比对,显示该预测蛋白质序列属于REF超家族。本研究首次克隆杜仲的橡胶延长因子基因c DNA序列,构建了表达载体p SH-35S-Eu REF 1,通过农杆菌介导法对烟草长脖黄进行遗传转化,经PCR检测和GUS组织染色,获得转基因烟草43株,移栽生长四个月的转基因烟草在表型上与野生型在叶片长宽比上有明显差异。     

甜瓜雄性不育系不同发育时期雄蕊转录组分析

从分子水平探讨甜瓜雄性不育雄蕊发育不同时期差异表达基因与花粉败育的相关性,为探究甜瓜雄性不育发生机理提供依据。通过对甜瓜雄性不育系(Male sterile,MS)花蕾(直径为2和5 mm时期)雄蕊进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行荧光定量分析。共发现224个差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能分析显示,全部基因均归属于生物合成、分子功能和细胞组分3大分支,其中与酶类相关的差异基因为9个,2个差异表达基因为羧酸酯酶同源基因,4个为碳水化合物相关酶类的表达基因,细胞信号传导相关表达基因和玉米素生物合成相关表达基因各1个;qRT-PCR(Quantitative realtime PCR)验证表明,与碳水化合物相关酶类的表达基因和玉米素生物合成相关表达基因在雄性不育株2 mm花蕾雄蕊中的表达量均低于5 mm花蕾雄蕊中的表达量,与细胞信号传导相关表达基因在雄性不育株2 mm雄蕊中的表达量高于5 mm雄蕊中的表达量。雄性不育的发生与能量代谢相关基因表达量的上升和细胞信号传导相关表达基因表达量的减少存在一定的相关性。     

杜仲内生真菌类群与分布的初步研究

从采自江苏和陕西的杜仲(Eucommia ulmoides)的组织中共分离获得254株内生真菌,根据形态学特征鉴定分属于9个属。研究结果表明从不同地点杜仲组织中以及从杜仲不同部位组织中分离获得的内生真菌的类群与分布存在明显差异。     

Influences of Special Damage Upon Exposed Surface of Girdled Trunk in Eucommia ulmoides

Mechanical injury to the exposed surface of the girdled trunk of Eueommia ulmo- ides Oliv. was conducted by scraping frames 10×l0 cm2 in four varieties of shapes, i.e. ∪、| |、Π and □ The scraping edge was 2 cm in width and 1 mm in depth. One month after treatment, periderm was formed at the central portion of all the scraped areas, however, among them the thickness, degree of differentiation and starch distribution of the regenerated bark were different. The newly-formed bark of the ∪ -shaped area was the thickest, and vascular cambium-like meristem was formed in the central portion which later gave rise to vascular tissues. The thickness of the newly formed bark in Ii -shaped area was half as :thick as the former, although similar tissue differentiation was observed. The thick- ness of the newly-formed bark inΠ-shaped area was half of that in∪ -shaped area. The flat meristematic cells were only seen in the deeper layer, and no vascular tissues were visible. The thickness of the newly-formed bark in the □ -shaped area was only 1/4 of that in ∪ -shaped area. There were undifferentiated parenchyma cells below the periderm in which very few flat meristematic cells were formed later.     

杜仲叶片和叶柄愈伤组织的诱导和植株再生

本实验以5~6年生杜仲叶片及叶柄为外植体,研究了杜仲愈伤组织诱导及植株再生的方法。结果表明:接种于补加NAA(2.0~4.0 mg/L)或BA(1.0 mg/L)+NAA(2.0~4.0mg/L)的MS培养基上的叶片和叶柄,经21~28d培养后,脱分化形成绿色或浅绿色致密愈伤组织,频率达到70%以上。绿色致密愈伤组织在补加BA(2.25~2.75 mg/L)+NAA(0.15 mg/L)的MS培养基上经过1~2次继代之后,即出现茎芽分化,频率在15%以上,只是其中许多都是畸形苗,正常苗频率较低。此问题尚在研究之中。选择生长健壮的再生植株,切除其基部愈伤组织,然后将切口浸泡在250mg/L无菌ABT生根粉溶液中3~5sec,再插入1/4强度无激素MS培养基中, 2~3周后,在苗基部长出1~3条白色粗壮的不定根,生根频率在60%以上。     

杜仲化学成分研究概况

本文综述了杜仲的药理、临床应用及其木质素类成分的结构类型及主要类型的结构测定方法。     

Development and characterization of microsatellite markers in Eucommia ulmoides Oliver (Eucommiaceae)

Twenty‐three microsatellite markers were developed from an AC‐enriched genomic library of Eucommia ulmoides, an economically important tree species for both herbal medicine and organic chemical industry in China. Nineteen microsatellite loci were found polymorphic by testing 36 individuals from 10 populations, with two to 14 alleles per locus. The expected heterozygosity ranged from 0.054 to 0.874. This set of microsatellite markers has provided a useful tool for the ongoing efforts in studying population genetic structure of E. ulmoides.     

中药杜仲原植物的分子鉴定

杜仲是我国特有贵重中药材,市场供不应求,各地出现许多伪品,为克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足,本研究旨在运用分子标记技术鉴定中药杜仲Eucommia ulmoides Oliv的真伪。采用PCR产物直接测序法测定杜仲原植物matK基因序列,通过Clustal软件将其与GenBank中同源序列进行排序比较,分析杜仲序列特征。结果:测定的杜仲matK序列长度为1140bp,同源序列比较分析表明,杜仲matK序列中存在32个特异性位点,其中特异性A、T、C、G位点分别为8,2,11,11,序列中有一个GAC插入为杜仲所独有。matK基因是良好的分子标记,能够为杜仲原植物鉴定提供足够的特异性变异位点,matK基因序列的测序分析可成为杜仲正品鉴定的有效手段。     

Abnormal Development of Regenerated Bark in Eucommia ulmoides

After the girdled trunk of Eucommia ulmoides Oliv. was locally damaged usually no bark was regenerated at the injured area. However, abnormal structures were observed in the newly-formed bark in the adjacent region. Similar results also occurred in simulated experiments. After girdling, a strip about 10×2 cm2 and 1 mm in depth was scraped in the exposed area ensuring no bark regeneration in this artificially ruined area. Hence one month after the treatment it was seen that new vascular cambium developed in the regenerated bark around the destroyed area. However, the newly-formed bark above the harmed area was about two-fold thicker than that below the area. The differentiation of cambium and starch distribution were quite different on both sides.     

杜仲内生菌的分离及产PDG菌株的筛选

从树龄达7a以上杜仲皮中分离得到122株内生菌,其中真菌75株,细菌47株,经摇瓶培养后分析各菌株产松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的能力,结果发现有8株菌能产生PDG,最高产量可达13.387 mg/L。经初步鉴定,这8株菌分属于5属,即茎点菌属(Phloma)、腐霉属(Pythium)、卵形孢霉属(Oospora)、球黑粉霉属(Tolypospori-um)、砖红镰孢霉属(Lateritium)。     

真菌联合稀碱预处理杜仲叶提取杜仲胶的工艺研究

以杜仲干叶为原料,经稀碱和绿色木霉联合处理以除去杜仲表面覆盖的角质层,同时洗脱一些可溶性杂质,并且破坏杜仲叶的细胞壁与纤维结构,再以石油醚作为提取溶剂,得到粗胶再经丙酮浸洗获得杜仲精胶。用0.45%NaOH在75℃下除去杜仲叶表面的角质层,并且同时脱除一些可溶性活性成分(如:多糖、黄酮类、京尼平苷等),之后得杜仲叶干燥,利用绿色木霉去破坏杜仲叶的细胞壁与纤维结构,在85℃条件下以石油醚作为提取溶剂提取杜仲胶。最后,经测得未处理前杜仲叶中的杜仲胶的含量为1.78%,0.45%NaOH稀碱预处理后含量为3.16%,绿色木霉发酵后含量为4.36%。预处理前,有机溶剂一次提取率为0.73%,纯度为83.7%。稀碱与真菌联合预处理后一次提取率为2.85%,纯度为96.6%。本工艺以稀碱与绿色木霉共同作用,减少了有机溶剂的用量,与传统工艺相比,更加的绿色环保,安全有效,为杜仲胶的提取提供了科学有效的依据。