小麦吸浆虫保幼激素酯酶和保幼激素环氧水解酶基因的克隆及在滞育和变态发育过程中的表达动态

【目的】保幼激素(juvenile hormone, JH)在小麦吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育诱导及滞育后静息状态的维持中发挥着重要作用。保幼激素酯酶(hormone esterase, JHE)和保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调控JH滴度的重要降解酶。本研究旨在探讨JHE和JHEH在小麦吸浆虫滞育和变态发育中潜在功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从小麦吸浆虫滞育前幼虫克隆JHE和JHEH全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析其核苷酸及编码蛋白特性;采用qPCR技术分析其在小麦吸浆虫滞育不同时期(滞育前、滞育期、滞育后静息期和滞育后发育)3龄幼虫及1龄幼虫到成虫不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹、后蛹、雌成虫和雄成虫)中的表达水平。【结果】克隆获得了cDNA全长分别为3 102和1 980 bp的小麦吸浆虫SmJHE和SmJHEH基因(GenBank登录号分别为MG876768和MG876769),其开放阅读框分别长1 740和1 371 bp,分别编码579和456个氨基酸,预测蛋白分子量分别为65.67和51.65 kD。SmJHE蛋白含有5个JHE家族特有的保守模块,SmJHEH含有催化三联体Asp228, Asp404和His431及组成阴氧离子洞的两个Tyr(Tyr299和Tyr374)和HGWP花样结构。序列比对和进化分析表明,SmJHE和SmJHEH均与双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)昆虫同源蛋白氨基酸序列一致性较高,亲缘关系最近。不同滞育时期的表达模式表明,SmJHE和SmJHEH在滞育前期(1龄到滞育前的3龄幼虫早期)表达量变化不明显,进入滞育后表达量基本维持恒定,但均在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月最低。发育表达模式表明,幼虫恢复发育后SmJHE表达量逐渐升高,预蛹期达到最高,在雌成虫中的表达量显著低于雄成虫中的;SmJHEH表达量则在预蛹期最低,在雌成虫中最高。【结论】SmJHE和SmJHEH参与小麦吸浆虫滞育调控,其表达量的降低与滞育后静息阶段JH的累积有关;SmJHE在发育过程中表达量的升高可能参与幼虫到蛹的变态,表达量的降低可能与生殖发育有关。     

低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

【目的】本研究旨在明确破茧率和破茧所需时间作为典型的专性幼虫期滞育昆虫麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育解除指标的可行性,探讨蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90在低温解除滞育中的作用。【方法】9月上旬采自田间的麦红吸浆虫滞育幼虫在低温(4℃)和自然变温处理不同时间(0~90 d)后转移至24℃化蛹,调查幼虫的破茧率、化蛹率及破茧和化蛹所需时间;采用qPCR技术分析4℃低温终止滞育并在24℃下恢复发育的幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的mRNA水平。【结果】不同时间低温(4℃)和自然变温处理的麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率和化蛹率以及破茧和化蛹所需时间均存在显著差异。未经低温(4℃)处理的幼虫在水分满足的条件下破茧率为71.3%,但均不能化蛹;低温(4℃)处理60 d内,随着处理时间的延长破茧率和化蛹率逐渐升高,破茧和化蛹所需时间逐渐缩短;与4℃低温处理30~60 d相比,自然变温处理30~60 d的幼虫化蛹率显著较低;4℃低温处理60 d和自然变温处理90 d后幼虫的化蛹率均超过91%。低温(4℃)处理显著提高了麦红吸浆虫幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的表达量,其中处理30 d时其表达量最高,随着低温(4℃)处理时间的延长,表达量逐渐降低,大部分幼虫滞育解除后表达量趋于恒定。【结论】低温能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除,效果优于9-10月自然变温;破茧率及破茧所需时间可作为评判麦红吸浆虫幼虫滞育强度的参考,但不能独立作为滞育解除的指标;EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平与滞育强度密切相关,在麦红吸浆虫滞育解除中发挥潜在作用。     

6种植物次生物质对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响

草食性昆虫取食植物时遇到宿主植物中大量次生物质的化学防御,研究昆虫适应植物毒素的反防御策略具有重要的科学意义。分别添加0.01%肉桂酸、0.01%水杨酸、0.01%花椒毒素、0.02%槲皮素、0.05%黄酮和0.1%香豆素等6种植物次生物质的人工饲料饲养斜纹夜蛾(Spodoptera litura)五龄幼虫48 h后,测定斜纹夜蛾幼虫中肠和脂肪体中谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)、P450的酶含量及头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,利用半定量RT-PCR检测中肠和脂肪体中CYP4M14和CYP4S9的基因表达水平。结果表明:取食肉桂酸和香豆素后,斜纹夜蛾中肠中CarE的酶活性分别提高了1.67和1.37倍,取食6种次生物质均能显著提高斜纹夜蛾脂肪体中GSTs酶活性。取食肉桂酸和香豆素48 h后,脂肪体中P450酶含量比对照增加2.93和14.50倍。取食肉桂酸、花椒毒素、槲皮素和香豆素后,斜纹夜蛾头部AchE酶活性与对照相比提高了1.53、1.80、2.36和1.56倍。6种次生物质均可诱导脂肪体中CYP4M14基因表达,槲皮素、肉桂酸和香豆素强烈诱导CYP4S9在脂肪体中表达。表明,斜纹夜蛾具有利用植物次生物质诱导其解毒酶的能力,进而提高其对毒素的抗性。     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和防御信号物质对斜纹夜蛾幼虫保护酶的影响

以广食性害虫斜纹夜蛾为研究对象,连续6代自二龄或三龄开始用含有大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,SBTI)的人工饲料喂养幼虫,饲养至五龄时测定SBTI对幼虫保护酶的影响。结果表明,SBTI抑制斜纹夜蛾幼虫SOD、CAT活性,随着饲养代数的增加,SBTI的抑制效果降低;SBTI可显著升高斜纹夜蛾幼虫POD活性。预先接触外源植物防御信号物质茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯48h均可显著影响斜纹夜蛾幼虫体内保护酶SOD、POD、CAT活性,且可显著减缓SBTI对斜纹夜蛾幼虫SOD、POD、CAT活性的作用效果。表明,斜纹夜蛾取食SBTI后能够调节自身的保护酶系统,逐步适应蛋白酶抑制剂的毒害,而预先接触植物防御信号物质可增强其对植物防御蛋白的适应能力。     

麦红吸浆虫幼虫不同滞育时期体内山梨醇含量及山梨醇脱氢酶基因表达水平变化

【目的】本研究旨在明确麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana(Géhin)滞育进程中山梨醇含量及山梨醇脱氢酶基因(SmSDH)mRNA表达水平的变化规律,探讨麦红吸浆虫滞育与山梨醇含量及SmSDH表达水平的关系。【方法】分别采用比色法和实时荧光定量PCR方法,对2013年5月-2014年3月不同时间陕西杨凌养虫圃内麦红吸浆虫滞育前后及滞育期幼虫体内山梨醇含量及SmSDH2a和SmSDH2b mRNA表达水平进行分析。【结果】麦红吸浆虫幼虫滞育前山梨醇含量最高(为9.41μg/mg);滞育期间,12月份含量最高(为8.50μg/mg);滞育解除后山梨醇含量为3.25~3.49μg/mg,显著低于滞育前和整个滞育期(P0.05)。山梨醇脱氢酶基因SmSDH2a及SmSDH2b在滞育进程中mRNA表达水平变化趋势相同,且与滞育强度递减趋势一致,即进入滞育后表达水平显著降低(P0.05)并一直稳定在较低水平,滞育解除后逐渐升高并达到最高。滞育期间,同期不同滞育状态幼虫之间山梨醇含量和SmSDH2a表达水平差异不明显,但裸露幼虫SmSDH2b表达水平始终高于结茧幼虫。【结论】山梨醇和SmSDH参与麦红吸浆虫滞育调控,与滞育维持和解除密切相关。     

大豆胰蛋白酶抑制剂和防御信号物质对斜纹夜蛾解毒酶的影响

在昆虫与植物漫长的相互作用中,植物合成多种抗虫物质并采用防御信号转导系统抵御昆虫,昆虫也具有多种解毒酶系统保护其免受植物毒素的毒害.本文研究了人工添加大豆胰蛋白酶抑制剂和植物防御信号物质对斜纹夜蛾幼虫羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响.结果表明:持续6代自幼虫2龄或3龄开始喂养含有大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料,其5龄幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高,2、3龄处理的继代幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶活性均在第二代达到最大值,分别为对照的2.06、2.40倍和1.96、2.70倍;其谷胱甘肽-S-转移酶活性则分别于第4、2代达到最大值,分别为对照的7.03、11.58倍和5.71、3.60倍,并呈现先升高再降低的趋势.预先接触外源信号物质茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯48 h和添加大豆胰蛋白酶抑制剂均可使斜纹夜蛾幼虫中肠、脂肪体内羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性显著升高,且预先接触茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯48 h可减缓大豆胰蛋白酶抑制剂对幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶活性的作用效果.     

大豆胰蛋白酶抑制剂和防御信号物质对斜纹夜蛾解毒酶的影响

在昆虫与植物漫长的相互作用中,植物合成多种抗虫物质并采用防御信号转导系统抵御昆虫,昆虫也具有多种解毒酶系统保护其免受植物毒素的毒害.本文研究了人工添加大豆胰蛋白酶抑制剂和植物防御信号物质对斜纹夜蛾幼虫羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响.结果表明： 持续6代自幼虫2龄或3龄开始喂养含有大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料,其5龄幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高,2、3龄处理的继代幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶活性均在第二代达到最大值,分别为对照的2.06、2.40倍和1.96、2.70倍;其谷胱甘肽-S-转移酶活性则分别于第4、2代达到最大值,分别为对照的7.03、11.58倍和5.71、3.60倍,并呈现先升高再降低的趋势.预先接触外源信号物质茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯48 h和添加大豆胰蛋白酶抑制剂均可使斜纹夜蛾幼虫中肠、脂肪体内羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性显著升高,且预先接触茉莉酸甲酯和水杨酸甲酯48 h可减缓大豆胰蛋白酶抑制剂对幼虫中肠和脂肪体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶活性的作用效果.