催化RNA的结构与功能

在核酶被发现以前,RNA就因为可以像蛋白质一样折叠成高度有序的结构而被预测可能具有催化的功能.该猜想在20世纪80年代得到了证明,四膜虫的Ⅰ型内含子RNA与负责tRNA成熟的核糖核酸酶RNaseP的RNA组分被发现具有催化功能.近年来,在核酶的结构和功能研究方面取得了很大进展,包括核糖体在内的多个核酶的高分辨率晶体结构被解析出来.本文介绍了这方面的最新研究成果.     

I型内含子核酶的研究进展

核酶具有特异识别和切割靶RNA的特点,从而可以抑制一些特异基因产物的表达,而I型内含子核酶,不但具有剪切功能,而且可以进行顺式剪接及反式剪接。随着人们对I型内含子核酶的功能结构也有了进一步认识,相继用I型内含子核酶对p53突变mRNA及镰形红细胞贫血等遗传性疾病致病基因mRNA的修复做了大量的研究,并取得了一定的成果。     

截短绿色荧光蛋白突变体反式剪接修复核酶

Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列（IGS）,可特异性地定点剪接目的基因RNA,从而在RNA水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料,克隆了其26S rRNA内含子核酶基因,体外转录证实该I型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能,构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白（GFP）的截短突变体重组质粒XYQ5/XYQ10pEGFP-C-2,并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用PCR和分子克隆技术,构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptrans-rib-CMV2,该核酶载体以克隆的26S RNA内含子为核心,选择EGFP编码区194位TG为剪接位点,以188-193位设计IGS序列,核酶3′端携带195-890bp的EGFP基因序列,连接于pRC-CMV2真核表达载体中。体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ5/10-pGEM和ptrans-rib-CMV₂,以混合转录产物为模板进行RT-PCR,电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFP mRNA,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒XYQ5/XYQ10- pEGFP-C₂与核酶质粒ptrans-rib-CMV₂共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光;RT-PCR检测出野生型EGFP mRNA,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,但其反式剪接效率低。     

小型核酶的结构和催化机理

自然界存在的小型核酶主要有锤头型核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒（HDV）核酶和VS核酶.锤头型核酶由3个短螺旋和1个广义保守的连接序列组成;发夹型核酶的催化中心由两个肩并肩挨着的区域构成;HDV核酶折叠成包含五个螺旋臂（P1～P4）的双结结构;VS核酶由五个螺旋结构组成,这些螺旋结构通过两个连接域连接起来.小型核酶的催化机理与其分子结构密切相关.金属离子或特定碱基都可作为催化反应的关键成分.锤头型核酶的催化必须有金属离子（尤其是二价金属离子）参与,而发夹型核酶则完全不需要金属离子.基因组HDV核酶进行催化时要有金属离子和特定碱基互相配合.     

大分子核酶的结构和催化机制

自然界存在的大分子核酶主要有第一类内含子,第二类内含子,RNase P的RNA亚基。它们的结构非常复杂。且都需要金属离子参加催化反应。     

基于卡那霉素抗性建立的研究I类内含子结构与功能关系的系统

Ⅰ类内含子（group I intron）是研究RNAs结构与功能关系的理想元件, 在 解释RNA折叠理论、催化机制等方面起着重要作用;对其结构与功能关系的研究也 因此成为一个非常重要的课题. 本研究建立了一个基于卡那霉素抗性进行Ⅰ类内含子结构与功能关系研究系统,将源于海洋蓝细菌Nostoc punctiforme（Npu）核糖核酸还原酶基因（ribonucleotide reductase,Rir）中的1个Ⅰ类内含子插入到pDrive质粒的卡那霉素抗性基因（kanamycin resistance gene,KanR）内构建得pKR12质粒并转化大肠杆菌（E.coli）. 只有内含子剪接的阳性克隆才能生成 KanR蛋白并在Kan抗性平板上生长. 结果显示,pKR12转入E.coli后不能在Kan抗性 平板上生长, RT-PCR检测仅可见前体带, 表明插入到KanR中的Npu Rir内含子没有发生剪接. 随后通过易错PCR建立内含子的随机突变库并用Kan抗性筛选进行定向演化, 产生有剪接活性的内含子突变体, RT-PCR检测显示剪接发生. 由于内含子剪接活性的改变可通过Kan抗性变化在LB平板上得以反映, 因此该系统有望成为简单快速地研究Ⅰ类内含子结构与功能关系的有利工具.     

抗TGFβ1核酶以及嵌合型核酶的细胞外和肝星状细胞内活性鉴定

大量研究表明转化生长因子β1参与细胞的多种生理和病理过程. 为了研究TGFβ1在这些过程中的详细发病机制, 设计了针对TGFβ1的非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶. 鉴定非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶的胞外以及活化型肝星状细胞内的活性. 核酶的胞外切割反应结果证实, 非嵌合型核酶的胞外活性优于U1小核RNA嵌合型核酶. 进一步研究发现, U1小核RNA嵌合型核酶在转染的肝星状细胞内可以高效下调TGFβ1的表达, 且其胞内活性明显强于非嵌合型核酶. 这些结果表明, 抗TGFβ1的U1小核RNA嵌合型核酶不仅为TGFβ1在细胞的生理和病理过程中具体作用机制的研究提供一种有效的工具, 而且有望为TGFβ1相关性疾病的治疗提供一个有效手段.     

生物的核酶及其功能

核酶是有催化功能的RNA,目前发现的核酶可分为两大类（大分子核酶,小分子核酶）,共7种（大分子核酶包括第一类内元,RNase的RNA组分;小分子核酶包括锤头型,发夹型,肝炎δ病毒核酶,VS核酶）。本文概括了这些核酶的功能及其在理论和实际（主要是医学）方面的应用情况。     

RNA在RNA剪接中的功能：从催化到调控

对非编码RNA功能的认识是后基因组时代的一个研究焦点,本文主要介绍非编码RNA在RNA剪接中的催化和调控功能。在RNA加工过程中,三大类内含子的剪接都是由RNA成员主导。其中Ⅰ型和Ⅱ型内含子能催化自身的切除和外显子连接反应;而核mRNA内含子的剪接则由剪接体里的小核RNA主导。Ⅰ型和Ⅱ型内含子存在于细菌、低等真核细胞和植物的细胞器内;而真核细胞的核编码蛋白质基因内全部是核mRNA内含子,并且其数目随生物体的复杂性而显著升高。一个多内含子前体mRNA通过选择性剪接产生多种,甚至上万种不同的mRNA和蛋白质,对蛋白质组的复杂度和时空表达调控至关重要。选择性剪接调控由剪接调控蛋白特异识别和结合前体mRNA里所富含的顺式RNA调控元件完成的;系统认识这两者之间的对应关系是揭示基因组表达调控网络的一把钥匙。     

Ⅱ型内含子及其生物技术应用研究进展北大核心CSCD

型内含子(groupⅡintrons)是一类具有自我剪接功能的核酶,能够通过“归巢”(retrohoming)机制高频插入到DNA靶位点。Ⅱ型内含子对DNA靶位点的识别和剪接具有高度专一性和高效性,这种特性使其在基因工程中具有重要的应用价值。文中首先综述了Ⅱ型内含子基因打靶原理及其在微生物遗传改造中的应用;然后,根据Ⅱ型内含子“归巢”特点及其依赖高浓度Mg2+的特性,分析了Ⅱ型内含子在多功能基因编辑及真核生物应用中的局限性;最后,以笔者课题组研究工作为基础,结合Ⅱ型内含子自身结构特点,分析了Ⅱ型内含子在新型基因编辑工具开发方面的潜能,为Ⅱ型内含子生物技术应用提供借鉴。     

内含子的特异性识别与选择性剪切

剪切反应是基因选择性表达中的重要环节之一,其过程主要包括2步:去除内含子及连接外显子。依据碱基序列和潜在折叠方式的差异,内含子可分为3种类型:Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子。其中前2类内含子能进行自我剪切,而Ⅲ类内含子的剪切反应则需由核RNA和蛋白质组成的剪接复合体介导。综述不同类别的内含子的识别与剪接机制,并对内含子在生物信息学中的应用做简要介绍。     

应用扫描隧道显微镜技术观察针对HBsAg基因转录物的核酶的二级结构

核酶(Ribozyme)是具有催化RNA切割反应功能的RNA,它可以特异性地切割RN-A。最近,核酶的一级结构已经被证实,其与底物结合时所形成的二级结构如锤头状(Hammerhead)、发夹型(Hairpin)结构,亦得到初步证实。因此,能够设计并人工合成核酶,通过特异性破坏RNA,阻断其功能,从而有效地阻止病毒的复制和繁殖。这是近年来继反义RNA之后发现的又一个抑制基因表达的有力工具,开辟了分子生物学的一个新领域。     

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。     

Ⅲ类内含子及其对基因表达的影响

内含子是指断裂基因中的非编码区序列。根据内含子的核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同,可分成四种类型：Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子、Ⅲ类内含子和Ⅳ类内含子。Ⅲ类内含子为真核细胞前mRNA中的内含子。它可以启动某些基因的表达,影响基因的表达量;增加mRNA分子的稳定性;并通过选择性剪接调控基因的表达。Ⅲ类内含子可以提高转基因动物基因的表达效率。因此,基因工程中,为了提高表达效率,是选用基因组基因还是cDNA基因,应视具体基因而定。     

U6嵌合型抗caspase-3核酶的体外及体内活性鉴定

为探讨caspase-3基因在细胞凋亡中的作用,及不同表达核酶的载体在体内的表达效果,本研究对比了3种表达核酶的真核质粒,包括RNA聚合酶Ⅱ启动的p1.5RZ107(自我剪切)和pRZ107及RNA聚合酶Ⅲ启动的嵌合于U6中的pU6RZ107在体外和在肝细胞BRL-3A内的活性,以期获得细胞内切割活性较高的的核酶载体方面的信息.结果显示,具有自我剪切功能的质粒p1.5RZ107在体外切割靶RNA的效率最高,几达80%;而体内caspase-3在RNA,蛋白水平及蛋白功能活性上均显著下降,证明核酶在体内均可有效地表达并切割底物,以pU6RZ107切割效率最高,约达65%,pRZ107次之,p1.5RZ107最低.结果表明,U6嵌合型核酶pU6RZ107体内可有效地表达核酶及下调靶RNA水平,这不仅为探讨caspase-3在凋亡途径中的作用,也可为今后的基因治疗提供研究基础.     

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。     

10-23脱氧核酶介导的生物传感器研究进展

近20年间,DNA介导的生物传感器得到了快速的发展,DNA能够作为遗传信息重要载体的同时,其折叠成的空间构象也具有很多的功能。功能核酸的概念逐渐引入到了包括生物传感、生物成像、医疗在内的重要领域中。10-23脱氧核酶作为功能核酸的一种,是通过体外筛选技术得到的,Mg²⁺存在的条件下能够特异性识别并切割RNA,切割位点为RNA中的嘧啶与嘌呤间的磷酸二酯键。由于其独特的识别以及切割能力,10-23脱氧核酶介导的相关疾病治疗得到了广泛的应用,同时人们逐渐开始关注10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建。对于10-23脱氧核酶的结构、性质、作用方式及改进修饰进行了介绍,并对10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建及应用进行了综述,旨为人们在未来使用10-23脱氧核酶搭建新型快捷生物传感器奠定理论基础。     

mRNA靶点筛选方法研究进展

mRNA靶点筛选问题是反义核酸领域的一个难题。近年来出现了多种筛选mRNA上可接近位点以确定靶位点的方法,包括mRNA实测分析法和计算机模拟分析两大类。其中mRNA实测分析法又包括多种针对自然折叠mRNA的实验分析技术;即基因walk技术,RNaseH作图技术、寡核苷酸微阵列技术,酶作图法确定二级结构技术,核酶导向型随机RNA库位点筛选技术和随机寡核苷酸库结合逆转录位点筛选技术。这些方法在鉴定RNA可接近位点及反义核酸的设计方面均有重要作用。     

10-23脱氧核酶介导的生物传感器研究进展

近20年间,DNA介导的生物传感器得到了快速的发展,DNA能够作为遗传信息重要载体的同时,其折叠成的空间构象也具有很多的功能。功能核酸的概念逐渐引入到了包括生物传感、生物成像、医疗在内的重要领域中。10-23脱氧核酶作为功能核酸的一种,是通过体外筛选技术得到的,Mg2+存在的条件下能够特异性识别并切割RNA,切割位点为RNA中的嘧啶与嘌呤间的磷酸二酯键。由于其独特的识别以及切割能力,10-23脱氧核酶介导的相关疾病治疗得到了广泛的应用,同时人们逐渐开始关注10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建。本文对于10-23脱氧核酶的结构、性质、作用方式以及改进修饰进行了介绍,并对10-23脱氧核酶介导的生物传感器的搭建以及应用进行了综述,为人们在未来使用10-23脱氧核酶搭建新型快捷生物传感器奠定理论基础。