含庚型肝炎病毒E2基因片段质粒DNA能诱发相当强烈的体液免疫应答

研究了庚型肝炎病毒E2(HGVE2 )基因片段作为DNA疫苗的可行性。将来自于质粒pThioHis-E2编码HGVE2的基因片段 (559bp)亚克隆到质粒pCMV-S中 ,使之和HBsAg基因位于同一阅读框 ,形成重组质粒pCMV-S-E2。用纯化的质粒pCMV-S-E2DNA注射到昆明小鼠后腿四头肌中来免疫小鼠 ,同时用pCMV-S作为对照。间隔 14天再加强一次免疫。在加强免疫后的第 8天眼眶取血。用E2-GST融合蛋白作为固定化抗原 ,通过ELISA检测受试小鼠的体液免疫应答。结果表明 ,用质粒pCMV-S-EDNA免疫的小鼠可以产生很强的体液免疫应答。     

银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆及鉴定分析

DREB类转录因子特异地与DRE元件结合,在植物感受非生物逆境(干旱、高盐和低温)胁迫时,激活一系列逆境应答基因的表达。我们选用银新杨(Populus alba×P. alba var. pyramidalis)为材料,通过PCR和同源EST搜索的方法克隆得到了一个类DREB的基因,命名为PaDREB2。酵母单杂交实验表明,该基因编码的蛋白能特异地与DRE元件结合并激活下游报告基因的表达。用RT-PCR的方法研究了PaDREB2的表达模式,结果表明PaDREB2受低温、干旱和高盐的胁迫诱导。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

应用mRNA差异显示技术克隆肿瘤转移相关基因TMSG-1

应用mRNA差异显示技术, 对比研究前列腺癌细胞系PC-3M具有不同转移潜能的亚系, 克隆差异表达片段, 经Northern杂交验证其在不同转移潜能的人类肿瘤细胞系中的表达差异, 测序, EST拼接获得cDNA全长序列, RT-PCR验证拼接结果并重复测序再次证实. 结果显示, TMSG-1在前列腺癌细胞系PC-3M不转移亚系2B4高表达, 而在高转移亚系1E8低表达, 二者差异显著. TMSG-1 cDNA全长序列2 kb, 开放读码框编码含230aa的蛋白质, GenBank Blastn检索与已知基因无显著同源性. 对TMSG-1所编码的氨基酸序列进行功能预测提示：TMSG-1是一个跨膜蛋白, 有3个跨膜区、3个蛋白激酶C磷酸化位点、 2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和1个N末端肉豆蔻酸酰化位点. 在6种人类常见肿瘤组织中, RT-PCR结果显示TMSG-1在前列腺癌中表达最强, 肺癌转移灶较肺癌原发灶表达显著降低, 低分化结肠癌较高分化结肠癌表达显著降低, 在复发性乳腺癌、卵巢癌、低分化胰腺癌(均无转移)中均有表达. 9例胃癌原发灶标本中, TMSG-1与b-actin RT-PCR扩增产物的灰度扫描(CNT×mm²)比值显示: TMSG-1在已发生转移的胃癌标本中的表达与无转移的胃癌标本相比有下降的趋势, t检验显示其差异有显著性(P < 0.05). 结果表明, TMSG-1基因表达水平的降低与肿瘤转移潜能的提高具有相关性.     

小鼠红细胞分化-去核因子的发育期相关性表达与鉴定

以质粒pBS-SK-MEDDF上的小鼠 MEDDF cDNA片段为模板,通过PCR方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到pGEM-T-Easy质粒中,经DNA序列测定后,证明其克隆序列正确,再将MEDDF编码序列定向克隆到表达载体pET-30α(+)的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建了原核表达载体,在获高效表达菌株中,特异表达蛋白质的量占细菌总蛋白的40%.以纯化的该蛋白质为抗原,免疫新西兰纯种大耳兔,获得高效价的抗血清.经免疫细胞化学验证,MEDDF在红细胞的表达具有发育阶段特异性,推测与小鼠红细胞终末分化的启动及细胞核浓缩相关.另外,MEDDF还在小鼠骨髓中的粒细胞系及巨核细胞系表达,说明该蛋白质与小鼠骨髓髓系细胞的分化有渊源关系.     

Sox2基因3''非翻译区保守元件对基因表达的调控作用

转录因子Sox2是脊椎动物早期发育中最早表达的神经系统特异性基因之一,同时在干细胞的维持中也起着关键作用。通过生物信息学分析,作者发现在脊椎动物Sox2 mRNA 3'非翻译区中存在4段非常保守的富含AU的区域。将这些片段按照不同的组合克隆到GFP和荧光素酶两种报告基因载体中,在非洲爪蟾胚胎和培养细胞中检测了这些片段对报告基因表达的影响。结果显示,Sox2的3'UTR可影响报告基因的表达水平,特别是其中的保守片段2可显著提高报告基因的表达水平,表明Sox2 3'非翻译区有可能参与Sox2表达的转录后调控。     

Smad3基因剔除致骨关节炎小鼠血清蛋白质组双向凝胶电泳分析

Smad3基因剔除导致小鼠骨关节炎。为了进一步深入研究Smad3基因缺失导致骨关节炎形成的分子机制,寻找骨关节炎发生早期的分子变化。用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术对Smad3基因剔除小鼠和野生型小鼠血清蛋白质组进行了初步分析。对其中7个表达差异蛋白质进行了鉴定,并探讨了所鉴定蛋白质与骨关节炎发生的关系。为揭示SMAD3介导的TGF-β信号在骨骼发育中的重要作用提供了线索。      

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

高压导致水稻变异品系发生DNA甲基化模式及基因组结构的改变

用高压力诱变水稻品种“毕粳38”, 产生了两个稳定的变异: 变异1与变异2. 对原种及两个变异品系的基因组DNA及Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切后的基因组DNA采用ISSR及RAPD分析; 并通过特异引物分析水稻的转座子mPing的变化; 且对变异片段纯化测序; 同时以水稻基因组中潜在活跃的反转录转座子LTR(long terminal repeat)Osr7, Osr36, Tos19(Osr54)以及转座子MITEs(miniature inverted-repeat transposable elements)的mPing和Pong及某些特异片段为探针, 进行Southern杂交. 结果显示原种及两个变异品系不仅存在着基因组结构的变异, 而且发生了DNA甲基化模式的改变. 此外, 对原种及两个变异品系进行了异地栽种, 其形态水平的变异稳定表达. 结果表明: 高静水压对高等植物的种子进行诱变, 产生表型变异的分子基础是由于发生了DNA分子水平上的广泛变异, 并证明高压可导致水稻多种转座元件的可能激活及DNA甲基化模式的改变. 因此可以认为高压是引起植物遗传变异一个重要因素, 可能在作物诱变育种中具有广阔的应用前景.     

来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 140kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET-2.2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH3.2 ,在pH 2.5～4.6范围内 ,酶活性保留 50%以上 ,它的最适温度65℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持50%以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+3288bp的基因片段amy′全长 2115bp ,编码705个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86% , Mesostigma viride 85%,Physcomitrella patens subsp.Patens 85%, Nephroselmis olivacea 84%。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaBcDNA序列。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响

研究Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响。实验小鼠分为5组,每组有Smad3基因剔除小鼠（Smad3^-/-）和其同窝孪生的野生型小鼠（Smad3^+/+）各1只。小鼠的造血功能用14天形成的脾结节(CFUS14)、多系祖细胞（CFUGEMM）、粒单系祖细胞（CFUGM）、红系祖细胞（BFUE）测定及外周血象、骨髓象等实验血液学指标来确定。每组小鼠取尾血作白细胞、红细胞和血小板计数,涂片作白细胞分类计数。将一侧股骨的骨髓冲出,制成单细胞悬液,计数其中有核细胞数,测定CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM值。将每只小鼠的4×10⁴个骨髓有核细胞,经尾静脉注入3只8～10周经致死量射线照射的同系雌性小鼠体内,测定14天的CFUS。取一部分胸骨、肝脏、脾脏固定做病理切片,其余胸骨冲出骨髓,涂片作分类计数。结果Smad3^-/-小鼠外周血白细胞和血小板计数明显高于Smad3^+/+小鼠,红细胞数无显著差异。外周血白细胞分类结果也表明粒细胞显著增高。骨髓有核细胞数无显著差异,CFU-GM显著增高,BFU-E 无显著差异,CFU-GEMM明显减少,CFU-S显著减少。病理形态学观察发现骨髓增生极度活跃,以粒系为主,肝脾无显著差别。骨髓涂片分类表明粒系增多,粒系：红系比例增高。因此得出结论Smad3基因剔除使小鼠造血干祖细胞数目减少,而且干祖细胞分化异常,向粒系分化增多。Smad3基因对造血系统的作用与TGF-β的作用有相关性。     

L24突变核糖体通过翻译终止调控λN基因的表达

从翻译延伸和终止两个方面研究了大肠杆菌核糖体蛋白质L24突变抑制Lambda噬菌体N基因表达的分子机理. 结果表明: 在lacZ和GST(谷胱苷肽巯基转移酶)为报道基因的表达质粒中, 通过lacZ和GST分别与λN 融合得到lacZ-λN和GST- λN融合基因, 它们在L24突变菌株中产生的β-半乳糖苷酶和谷胱苷肽巯基转移酶的活性分别下降至野生型T83菌株的1/4和1/2左右; 改变GST- λN融合基因的翻译终止密码子附近的序列, 能使GST-融合蛋白的产量恢复到T83菌株的水平. 原因可能是L24突变核糖体参与组成的翻译终止复合物有功能上缺陷, 在翻译终止某些基因, 如λN基因时, 能使核糖体暂停在终止密码子附近, 减慢翻译终止, 影响λN基因的表达. 其中, λN 基因终止密码子上游仅2个密码子的改变可消除L24突变对λN基因表达的抑制.     

紫杉醇合成代谢途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

紫杉烯合成酶(Taxadienesynthase)被认为在紫杉醇合成代谢途径中起着限速酶的作用。为进一步研究紫杉烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RTPCR技术从东北红豆杉(Taxuscuspidata)愈伤组织中获得了紫杉烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMTEasyVector上,并转化到大肠杆菌JM109中,经EcoRI酶切检测,Southernblotting及部分cDNA序列分析证实该片段确为紫杉烯合成酶基因,与国外报道的从太平洋红豆杉(Taxus.brevifolia)幼茎中得到的紫杉烯合成酶基因序列具有很高的同源性。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因启动子区的克隆及初步的功能分析

利用双链接头介导PCR的染色体步行技术, 克隆了油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因上游1.6 kb的调控区域(GenBank登录号为AF472487). 序列分析表明, 该片段中含有种子萌发特异性序列及维管束特异性序列. 将其全长片段及5′端不同长度的缺失片段与gus(uidA)基因连接构建植物表达载体, 转化烟草. GUS组织化学染色表明, 全长1.6 kb片段具有较强的启动子活性. GUS染色主要分布在细胞迅速增生的部位及维管束组织中. 启动子缺失试验的GUS染色结果表明, -1610~-1030 bp区段的缺失使gus基因的表达明显变弱, 推测该区段含有启动子的正调控元件; -1030~-902 bp可能存在强烈抑制基因表达的负调控元件; -902~-19 bp的片段亦可驱动gus基因的高水平表达.     

二花脸和大白猪脂肪leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达的发育性变化

为研究猪脂肪组织中leptin和下丘脑中Ob-Rb基因表达发育性变化的性别差异和品种特点, 分别于出生当天, 3, 20, 30, 45, 90, 120和180日龄随机屠宰二花脸公、母猪, 大白猪公猪各4头, 采集血样、背部皮下脂肪组织和下丘脑. 用放射免疫法测定血清leptin浓度, 用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)方法, 以18S rRNA作内标, 定量分析脂肪组织中leptin和下丘脑Ob-Rb基因表达的发育性变化, 并进行品种和性别间比较. 结果显示: 脂肪组织中leptin mRNA的表达有明显的发育性变化, 随日龄增加而增高, 母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 二花脸猪和大白猪血清leptin水平的发育性变化模式基本相同, 随日龄增加而增高, 且与脂肪组织中leptin mRNA表达的发育性变化高度正相关(P<0.05或P<0.01), 有性别和品种差异, 总体上母猪显著高于公猪, 二花脸猪显著高于大白猪(P<0.01). 而下丘脑中Ob-Rb mRNA的表达呈现明显不同的发育及品种特点, 在出生后逐渐下降, 然后逐渐回升, 断乳后又逐渐下降, 二花脸猪在120~180日龄又逐渐回升. 大白猪Ob-Rb的基因表达在总体上高于二花脸猪(P<0.01). 结果提示: 二花脸猪和大白猪血清leptin水平和脂肪组织中leptin的基因表达与脂肪沉积相关.     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。