HIV-1 TAT蛋白转导肽的研究进展

TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用,而且能够携带这些外源生物大分子通过活体细胞的各种生物膜性结构(如细胞膜和血脑屏障等)并发挥生理功能,但其跨膜转导机制仍不明确。新近研究还发现TAT核心肽段在促进外源蛋白高效表达过程中也具有重要作用,能够显著增加外源蛋白高效、可溶性表达的水平,显示了TAT蛋白转导肽的新功能。以TAT蛋白转导肽跨膜转导作用的长期研究背景为基础,分别从TAT蛋白转导肽的结构特点、其跨膜转导作用的影响因素及其作用机制等方面进行了系统综述,进一步结合TAT蛋白转导肽的最新研究进展分别从药物研发、机制探索及新功能的开发等方面展望了后续研究方向与应用价值,不仅为深入阐述TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用的功能意义提供了参考依据,而且为TAT蛋白转导肽在微生物工程及蛋白质工程等领域的潜在应用价值提供了重要参考信息。     

带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。     

TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性的研究

HIV-TAT蛋白转导域（PTD）是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,转导效率高而对细胞没有损伤.构建了TAT-EDAG、TAT-GFP融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中实现了两种融合蛋白的可溶性原核表达,在非变性条件下进行蛋白纯化,获得了纯度在90%以上的融合蛋白.脱盐处理后,利用TAT-GFP转染体外培养的鼠成纤维细胞证实了TAT转导肽的生物活性;利用TAT-EDAG转染体外培养的HL-60细胞,Western blotting分析表明：TAT-EDAG可以导入HL-60细胞中.这为下一步应用于体外造血干细胞扩增研究奠定了基础.     

核衣壳蛋白VP39融合TAT转导肽对杆状病毒转导哺乳动物细胞的影响

为了提高昆虫杆状病毒在哺乳动物细胞中转导基因的效率,构建了重组杆状病毒AcRed-tat和AcRed。两者都能在哺乳动物细胞内表达红色荧光蛋白作为报告基因。同时,AcRed-tat带有HIV-1Tat转导肽、病毒主要衣壳蛋白基因vp39及增强型绿色荧光蛋白(egfp)三者的融合基因,并由杆状病毒多角体启动子表达,能够在昆虫细胞中表达该Tat融合蛋白,并掺入子代病毒粒子。而AcRed作为相应的对照病毒,带有多角体启动子表达vp39和egfp的融合基因。2株病毒分别转导哺乳动物细胞后,利用流式细胞仪检测报告基因的表达水平,发现在CHO和Vero细胞中AcRed-Tat介导的报告基因表达水平明显高于AcRed,而在HEK293细胞中2株病毒介导的报告基因表达水平差异不显著。结果表明Tat转导肽可以提高杆状病毒对一部分哺乳动物细胞的转导效率,为改进杆状病毒-哺乳动物细胞转导载体提供了新的思路。     

蛋白转导域透膜作用的研究进展

HIV-TAT蛋白转导域（Protein transduction domain,,PTD）是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,源自人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱性氨基酸多肽,能与多肽、蛋白质及DNA等分子连接并跨膜导入绝大部分的组织细胞或透过血脑屏障,转导效率高且对细胞无损伤。TAT-PTD与细胞膜之间的电荷作用,吸附于膜表面,依赖脂筏介导的巨胞饮作用进入细胞。TAT融合蛋白系统是一种极有价值的运载工具,在基础医学研究和临床治疗方面有着广泛的应用前景。     

多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送

增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。     

HIV-Tat蛋白转导域在医学研究中的应用

HIVTat蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,甚至可以通过血脑屏障,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具,在基础医学研究和临床治疗方面都有着非常广泛的应用前景 。     

TAT蛋白转导域：蛋白质治疗的新曙光

TAT蛋白转导域是源自人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱性氨基酸多肽,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力.TAT蛋白转导域首先通过电荷相互作用吸附于细胞膜,然后通过脂筏介导的巨胞饮作用进入细胞.随着体外研究的不断成熟,应用TAT蛋白转导域治疗人类肿瘤、卒中、炎症等疾病的动物模型也获得了成功,TAT蛋白转导域进入临床指日可待.     

HBx-EGFP-TLM融合蛋白表达载体的构建、蛋白表达纯化及活性检测

乙型肝炎病毒X蛋白 (HBx) 具有广泛的转录激活作用,但是由于细胞类型和实验条件的差异,外源启动子介导的HBx瞬时表达水平常表现出不均一性,为其功能的研究带来困难。为了解决HBx研究过程中遇到的这些难题,利用PCR扩增获得HBx及含转导肽TLM的EGFP编码序列,经酶切后插入pGEX-4T-1原核表达载体,成功构建重组质粒pGEX-HBx-EGFP-TLM和pGEX-EGFP-TLM。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞,融合蛋白经IPTG诱导表达,采用?KTATM Purifier 蛋白纯化系统纯化并进行SDS-PAGE和Western blotting分析,确定为目的蛋白。将纯化后的融合蛋白分别与AML12和SMMC-7721细胞共孵育,Western blotting和激光共聚焦显微镜检测证实TLM转导肽能够介导HBx-EGFP和EGFP进入细胞,同时进入细胞的HBx-EGFP-TLM能够发挥转录激活活性,为HBx功能的深入研究奠定了基础。     

含蛋白质转导域的Ngb融合蛋白的原核表达、纯化及其生物学活性的初步研究

以SD大鼠脑组织RNA为模板,利用RT-PCR技术,将HIV-1反式激活蛋白(TAT)中具有蛋白质转导功能的9个氨基酸序列,即蛋白质转导域(PTD)基因与脑红蛋白(Ngb)基因融合,应用T-A克隆技术将融合基因与pMD19-Tsimple载体连接,经测序正确后克隆至表达载体pET28b中,转化感受态E.coli BL21(DE3)plysS,得到的转化子经IPTG诱导后获得可溶性表达,并经蛋白质印迹检测进一步鉴定.表达产物经Ni2 亲和纯化层析、脱盐后在原代培养的大鼠皮质神经元进行生物学活性检测,结果显示,TATPTD-Ngb融合蛋白可以转运入皮质神经元内,在48h内可检测到其存在,并能提高缺氧条件下皮质神经元存活率、减少缺氧诱导的皮质神经元的凋亡.这一结果为进一步研究TATPTD-Ngb的神经保护机制提供了线索,并可能为神经系统疾病尤其是脑血管疾病、神经系统退行性疾病提供一个新的治疗策略.     

基因治疗慢病毒载体的转导增强策略*

基于慢病毒载体的体外基因治疗已在临床试验中取得良好的效果,有望治愈一些造血系统的单基因遗传病。通过提高靶细胞转导效率和减少转导中病毒载体量,基因治疗有效性、安全性和成本都可以得到改善。不同包膜糖蛋白伪型慢病毒载体通过与细胞膜表面的不同受体结合,促进病毒黏附和入胞,增强不同靶细胞的病毒转导效率。此外病毒转导增强剂可以在病毒进入细胞过程或进入后发挥作用,在提高转导效率的同时使靶转导基因在体内长期稳定表达。通过对这两类方法的总结回顾,旨在为慢病毒载体的转导效率提供新的优化策略,使基因治疗得到更广泛的应用。     

赤霉素信号转导与植物的矮化

论述近年来在拟南芥、水稻等模式植物中赤霉素信号转导的研究进展。通过对赤霉素相关突变体的生理研究 ,鉴定出几个介入赤霉素信号转导过程的重要基因 ,并对这些基因的产物进行分析 ,根据相应的蛋白特征结构域 ,推导了它们可能具有的功能。利用双突变体 ,分析了这些基因的上下游关系 ,确定了在植物中 ,GA信号转导的几个途径。在此基础上提出了赤霉素信号转导的基本模式 :阻遏是GA信号转导过程中最基本的方式 ,GA信号通过去除阻遏作用来激活转导途径 ,从而调节GA相关的生长与发育。     

拟南芥乙烯信号传递途径

植物激素乙烯早在一百多年前就已经被确认,相关的研究使得乙烯广泛地被应用于农业上.一直到十年前第一个植物激素乙烯受体拟南芥ETR1基因被发现之后,人们对于乙烯信号传递的研究并才真正开始有所突破.以遗传学为基础对乙烯反应突变体所做的分析,使得乙烯信号传递已经成为目前植物信号传递领域中被研究得最清楚的信号传递途径之一.该文着重于回顾乙烯信号传递途径上各个元件的发现和确认,以及如何利用遗传学的方法将现有的突变体相关基因构建出目前广为接受的信号传递的遗传模式.最后,该文就目前所知的乙烯信号传递理论及相关研究,做了总结和深入的讨论.     

乙烯信号传导的研究进展

植物内源激素乙烯作为信号分子通过信号传导途径调节相关基因表达 ,控制植物体的多种生理活动。乙烯信号传导途径中的许多基因已被克隆定性 ,综述了乙烯信号传导途径中的相关基因的功能及乙烯信号传导模式。     

光敏色素分子及其信号转导途径

作为植物体内的一种光受体,光敏色素在植物的光形态建成过程中意义重大。植物光敏色素及由它介导的信号传导途径是目前细胞生物学、发育生物学和分子生物学研究的热点之一。本文介绍了光敏色素的分子特性、生理功能和信号转导途径等方面的研究进展。     

短小芽孢杆菌的遗传转导

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)噬菌体PP5在碱性蛋白酶生产菌珠B.pumilus 289中能进行普遍性转导。PP5对于B.pumilus 289的营养标记的转导频率为10~(-6)转导子/PFU。对于B.pumilus 1037和B.pumilus 289之间的链霉素抗性标记的转导频率为10~(-4)至10~(-7)转导子/PFU。从而建立了一个新的B.pumilus遗传转导系统。     

蛋白质组学方法在细胞内信号转导研究中的应用

蛋白质组学的新技术为我们研究细胞内的信号转导过程提供了更广泛和崭新的思路,它克服了传统技术的局限性,实现了对蛋白的高通量分析。简要综述了蛋白质组学技术在信号转导过程中信号分子的确定、定量,磷酸化等翻译后修饰的识别,以及蛋白质之间相互作用研究等方面的应用。     

细胞分裂素信号转导研究进展

对应用突变体研究细胞分裂素信号转导、细胞分裂素受体以及参与细胞分裂素信号转导相关的蛋白质作了简要介绍 ;并且对细胞分裂素信号途径进行了推测 :细胞分裂素被受体 (CKI1、IBC6或者GCR1 )接受后 ,经传导系统转化形成特定的信息 ,一方面可能调节基因的表达 ,从而可能调节受体水平 ,导致细胞对细胞分裂素浓度应答范围发生改变 ,另外 ,基因表达使细胞产生相关的生理反应 ;另一方面形成的特定信息可能激活MAPK级联途径 (mitogen_activatedproteinkinasecascade) ,导致细胞产生相关的生理反应。