脂质体DC-Chol/DOPE对HEK293FT细胞的高效转染及其在腺病毒制备中的应用

重组病毒载体系统因为具有高效的基因转移能力得到了广泛应用,而病毒包装细胞的转染是重组病毒制备过程中的关键步骤。优化了脂质体DC-Chol/DOPE介导的转染常用的病毒包装细胞系HEK293FT的实验条件,比较了DC-Chol/DOPE、Lipofectamine2000和磷酸钙共沉淀法转染细胞的效率,并且比较了用DC-Chol/DOPE和磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备重组腺病毒的结果,发现DC-Chol/DOPE对293FT细胞的转染效率以及最终收获的病毒滴度都远高于磷酸钙共沉淀法转染。所以,利用DC-Chol/DOPE转染293FT细胞制备重组病毒是一种简单、高效、成本低廉的方法。     

利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。     

多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送

增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。     

提高蛋白质和多肽类药物代谢稳定性的研究进展

蛋白质和多肽类药物在体内存留时间的长短极大地影响到药物的使用剂量和治疗效果。本文综合现有的资料,对包括蛋白酶的作用、物理和化学变化、给药方式等影响该类药物代谢稳定性的因素以及相应的解决方案作一综述。     

用Rnase Ⅲ制备的小干涉RNA降解SARS冠状病毒基因的细胞内转录物

SARS冠状病毒是引起重症急性呼吸综合症的主要原因,目前尚没有特效药物或疫苗对抗这种新病毒。RNA干涉是指双链RNA可以特异地降解细胞内同源基因的Mrna。在哺乳动物细胞中,<30bp的小双链RNA能引起RNA干涉,又可以避免干扰素反应。通过体外转录得到SARS病毒3种基因RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白及核衣壳蛋白部分片段的长双链RNA,然后用Rnase Ⅲ有限切割成长度<30bp的小干涉RNA。同时把上述3种基因片段分别连接到质粒Pgl3-Control中,得到的3个质粒Pgl-R、Pgl-S和Pgl-N可以分别在细胞内转录出荧光素酶RNA依赖的RNA聚合酶、刺突蛋白、核衣壳蛋白的杂合Mrna。上述质粒分别和相应的小干涉RNA共转染HEK293F细胞,测定荧光素酶活性,结果小干涉RNA使相应质粒表达荧光素酶的活性显著下降;用逆转录定量PCR反应测量Mrna丰度,结果表明上述小干涉RNA可以特异地降解相应的病毒基因转录物。     

基质金属蛋白酶2、9和血管内皮生长因子在碱烧伤小鼠角膜组织中的表达

采取滤纸片放置法,用1mol／L的NaOH在小鼠角膜中央进行碱烧伤,建立动物模型。取烧伤前和烧伤后的小鼠角膜制备组织切片,用抗MMP2、抗MMP9和抗VEGF的抗体分别进行免疫组化染色,检测它们在碱烧伤前后的小鼠角膜组织中的蛋白表达情况;提取碱烧伤前和碱烧伤后不同时间点的小鼠角膜组织的总RNA并进行逆转录,以获得的逆转录产物作为模板,用特异的引物和探针进行实时定量PCR,分别检测MMP2、MMP9和VEGF在碱烧伤前后的小鼠角膜组织中转录水平的变化;提取碱烧伤前后小鼠角膜的蛋白组分,用明胶底物酶谱的方法检测其中MMP2和MMP9的活性变化。结果表明,浸透1mol／L的NaOH的滤纸小片,对小鼠角膜进行碱烧伤可以有效地诱导角膜新生血管形成,烧伤后3-4d就有明显的新生血管形成,至第8、9d左右开始退行。免疫组化结果显示,正常角膜中没有MMP9和VEGF表达,MMP2表达极低;碱烧伤后3种因子的表达均上升。实时定量PCR的结果显示MMP2在碱烧伤后表达升高,第3d达到最高随后下降;MMP9在正常角膜组织中没有表达,碱烧伤后第1d达到最高之后开始下降;VEGF在正常角膜中也没有表达,碱烧伤后第4d达到高峰之后开始下降。以上结果说明碱烧伤后的角膜组织中MMP2、MMP9和VEGF的表达均经历先上升后下降的变化,与角膜愈合及新生血管发育和退化过程相吻合。     

通过生物素化标记分析细胞膜亚蛋白质组

细胞膜在许多基本生物学作用过程中扮演着重要角色,比如细胞-细胞相互作用、信号转导和物质运输.分析不同生理或病理状态细胞的膜蛋白的表达变化,有助于了解这些生物学过程以及发现新的诊断、治疗靶位.成功地进行膜蛋白分析最重要的是获得足够浓度与纯度的膜蛋白.这里报告一种分离高纯度膜蛋白的方法,主要包括三个步骤：（1）生物素化活细胞表面的膜蛋白,（2）链亲和素琼脂糖亲和吸附,（3）强烈的清洗条件去除非特异吸 附的胞质蛋白.最后用化学方法洗脱生物素标记的膜蛋白进行双向电泳分离分析.用该方法 制备了HeLa细胞的膜蛋白.免疫印迹结果表明,生物素标记的膜蛋白基本上都是低丰度蛋白. 这样制备得到的膜蛋白双向电泳分离出2 400多个蛋白质点,而且大多数点的亮度相近,分 布得相对分散没有聚集成群.这种图谱非常便于比较分析找到差异蛋白.多次重复制备膜蛋白 、电泳表明该方法的重复性和稳定性很好.     

非洲绿猴层黏连蛋白受体的克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达非洲绿猴层黏连蛋白受体(LR),对该受体蛋白进行纯化、复性研究。方法:采用RT-PCR从Vero-E6细胞总RNA中扩增非洲绿猴LR的cDNA序列,克隆到pGEM-TEasy载体上;将LR编码区插入到表达载体pET22b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG进行诱导表达;用镍亲和柱进行亲和纯化;采用分部透析方法进行复性。结果:非洲绿猴LR基因序列与人LR的基因编码序列有16个碱基差异,但蛋白序列只有1个氨基酸的改变。LR蛋白以包涵体形式表达。采用分部透析方法可使部分蛋白得到复性。结论:克隆了首个非洲绿猴的相对分子质量为37000的LR的基因,与人LR基因序列有16个碱基差异,但其中15处都为同义突变,所以二者的蛋白质序列只有1个氨基酸改变,即293位D→E,提示LR在进化中具有很大的保守性。     

利用TAT多肽增强腺病毒对细胞感染效率的研究

蛋白转导多肽本身或携带生物大分子能以一种不明机制的方式高效地穿过真核细胞质膜并且几乎没有组织选择性。这为生物药物研究、基因治疗等领域带来了新的希望。最近有研究表明:来源于HIV-1的TAT蛋白的蛋白转导结构域多肽可以显著地提高重组腺病毒感染细胞和实验动物的效率。在对。HeLa且和Vero-E62种具有不同病毒易感性的细胞进行重组腺病毒感染实验时发现TAT多肽可以明显地提高重组腺病毒对HeLa细胞的感染及在细胞中外源报道基因的表达,但是对Vero-E6细胞却没有效果,表明TAT多肽增强重组腺病毒的感染与靶细胞类型有关,而并不像转导现象那样没有组织差异。这为蛋白转导技术在病毒载体中的应用提供了参考,但其中涉及的蛋白转导的机制有待进一步实验研究。