子宫内膜异位症中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化研究

目的：探讨错配修复基因1（hMLH1）、错配修复基因2（hMSH2）启动子区甲基化与子宫内膜异位症的关系。方法：采用甲基化特异性PCR方法检测23例子宫内膜异位症组织和20例正常子宫内膜中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态。结果：hMLH1基因在子宫内膜异位症中的甲基化率为39％（9/23）,在正常子宫内膜组织中的甲基化率为5％（1／20）,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;hMSH2基因在子宫内膜异位症中的甲基化率为8％（2／23）,在正常子宫内膜组织中的甲基化率为5％（1／20）,两者比较,无明显差异（P〉0．05）。结论：hMLH1基因启动子区甲基化可能与子宫内膜异位症发病有关;hMSH2基因启动子区甲基化与子宫内膜异位症之间不存在显著联系。     

p16基因甲基化与表达在子宫内膜癌中的意义

肿瘤抑制基因p16定位于9号染色体短臂2区1带,编码细胞周期调节蛋白p16,p16基因失活将导致细胞增殖失控。研究证实肿瘤抑制基因启动子区域5CpG岛甲基化是导致转录水平上基因失活的重要机制。为了研究p16基因甲基化状态及其表达异常与子宫内膜癌发生的关系,采用甲基化特异性PCR(MSP)、免疫组化及PCR方法检测62例子宫内膜癌及相应癌旁组织、10例相应年龄正常子宫内膜中p16基因5′cpG岛甲基化状态、p16蛋白表达及p16基因外显子E,和E：表达缺失情况。结果表明癌旁及正常子宫内膜p16基因无甲基化,且无p16蛋白、外显子1和2的表达异常。62例子宫内膜癌中,15例甲基化,占24、2％;33例p16蛋白表达下降或无表达,占54．8％;p16基因外显子1缺失率16．1％(10／62),外显子2缺失率为30．6％(19／62),两者均缺失9．68％(6／62),至少其中1种缺失46、6％(29／62)。提示P16基因失活在子宫内膜癌中多见且与病理分级、临床分期密切相关。D16基因甲基化在子宫内膜癌的发生中起着重要作用。MSP法测定基因甲基化状态准确且简便可行。     

子宫内膜癌患者P16 基因甲基化和血清CA125 检测的临床意义

目的:探讨子宫内膜癌患者P16基因甲基化和血清CA125检测的临床意义。方法:采用DNA甲基化特异性PCR分别对46例子宫内膜癌及12例正常内膜对照组织中抑癌基因p16甲基化进行检测;对所有病例术前均测定血清CA125水平。结果:子宫内膜癌组p16甲基化率45.6%,而12例对照组织均未检测到甲基化;子宫内膜癌组血清CA125水平明显升高。结论:子宫内膜癌患者p16基因甲基化和血清CA125水平与发病关系密切,两者结合对早期诊断及预后判断具有一定的临床指导意义。     

子宫内膜癌患者P16基因甲基化和血清CA125检测的临床意义

目的：探讨子宫内膜癌患者P16基因甲基化和血清CA125检测的临床意义。方法：采用DNA甲基化特异性PCR分别对46例子宫内膜癌及12例正常内膜对照组织中抑癌基因p16甲基化进行检测;对所有病例术前均测定血清CA125水平。结果：子宫内膜癌组p16甲基化率45．6％,而12例对照组织均未检测到甲基化;子宫内膜癌组血清CA125水平明显升高。结论：子宫内膜癌患者p16基因甲基化和血清CA125水平与发病关系密切,两者结合对早期诊断及预后判断具有一定的临床指导意义。     

卵巢癌中线粒体转录终止因子1的表达及其意义

目的:探讨人线粒体转录终止因子1(MTERF1)在卵巢癌中的表达及其在预后判断中的作用。方法:利用Oncomine数据库对比分析卵巢癌和正常卵巢组织中MTERF1基因表达水平;提取10例配对卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织总RNA和蛋白质,real time RT-PCR检测MTERF1 mRNA在各组织中的表达,Western印迹检测MTERF1蛋白在各组织中的表达;利用Kaplan-Meier plotter数据库分析MTERF1表达对卵巢癌患者的预后价值。结果:Oncomine数据库中共收集了8个不同类型的研究结果,荟萃分析显示MTERF1在卵巢癌中表达增高,且差异具有统计学意义(P0.05)。本研究10例卵巢癌及其配对的正常卵巢上皮组织中,有6例卵巢癌中MTERF1 mRNA和蛋白质表达水平增高。Kaplan-Meier plotter数据库分析显示,MTERF1 mRNA表达水平越高,早于2期的卵巢癌患者无进展生存期越短,预后越差(P0.05);但卵巢癌患者的总生存期与MTERF1 mRNA表达水平无相关性(P0.05)。结论:卵巢癌组织中MTERF1 mRNA和蛋白质表达升高;在早期卵巢癌患者中,MTERF1表达水平越高,预后越差,可作为预测卵巢癌患者预后的潜在分子标记物。     

腹部脂肪组织APN基因DNA甲基化及mRNA表达与维吾尔族T2DM的相关性

为探讨APN基因启动子区DNA甲基化及mRNA表达与新疆维吾尔族T2DM发生、发展的相关性,文章选择新疆维吾尔族正常个体50例、肥胖个体48例、肥胖伴T2DM个体26例,收集腹部网膜脂肪组织,利用变性高效液相色谱技术检测APN基因启动子区DNA甲基化情况,应用Real-time PCR方法检测APN 基因mRNA表达情况。结果显示,APN基因启动子区DNA甲基化阳性率在正常对照(34%)、肥胖(47.9%)及T2DM组(65.4%)逐渐增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,正常对照组APN mRNA相对拷贝数(0.7162)显著高于肥胖(0.4244)及T2DM组(0.4093),差异具有统计学意义(P<0.05)。非T2DM个体相关性分析提示,APN mRNA相对拷贝数与空腹血清葡萄糖(Fasting plasma glucose, FPG)、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin, HbA₁c)、甘油三酯(Triglyceride, TG)水平显著负相关(P<0.05)。APN基因启动子区DNA甲基化与其mRNA表达负相关,甲基化阳性组相对拷贝数(0.2700)显著低于阴性组(0.7870),差异具有统计学意义(P<0.01)。以上结果提示,APN基因启动子区DNA甲基化通过抑制其 mRNA表达导致糖脂代谢紊乱,可能参与了新疆维吾尔族肥胖及T2DM的发生、发展过程。     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

PTEN蛋白在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的　探讨抑癌基因PTEN产物PTEN蛋白在由正常子宫内膜过渡至子宫内膜癌过程中的表达缺失情况及其临床意义。方法　用SP免疫组化法测定 73例子宫内膜癌、 2 5例子宫内膜非典型增生、 71例子宫内膜增殖症和 31例正常子宫内膜组织中PTEN蛋白的表达 ,并与组织学类型、组织学分级、肌层浸润深度和临床分期等生物学行为进行相关分析。结果　PTEN蛋白在子宫内膜腺癌和癌前病变中的表达缺失率分别为 6 6 6 7%和 76 0 0 % ,表达缺失率与组织学类型(P <0 0 0 5 )和组织学分级有关 (P <0 0 5 ) ,与子宫内膜癌肌层浸润深度和临床分期无关 (P >0 0 5 )。结论　PTEN表达缺失是子宫内膜癌发生的早期分子事件 ,PTEN蛋白表达缺失是早期诊断子宫内膜癌及癌前病变较好的生物标志。     

卵巢上皮癌中ING4基因启动子的甲基化状态及其临床意义

目的：探讨卵巢上皮癌中ING4基因启动子的甲基化状态及其临床意义。方法：收集2005年7月至2012年6月哈尔滨医科大学附属第一医院行全面分期手术并经病理检查确诊的150例卵巢上皮癌组织标本,并以同期因子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫全切除术或次全切除术并经病理检查确诊为正常卵巢组织的150例标本作为对照组。采用甲基化特异性PCR（MSP）技术检测卵巢上皮癌组织与正常卵巢组织中ING4基因启动子的甲基化状态,蛋白印迹法检测1NG4蛋白的表达,并分析ING4基因启动子的甲基化状态与卵巢上皮癌临床病例特征的关系。结果：卵巢上皮癌组织中ING4基因启动子的甲基化阳性率为42．7％（64／150）,明显高于正常卵巢组织（4％,6／150）,差异有统计学意义（P〈0．05）。ING4基因启动子甲基化阳性的卵巢上皮癌组织中ING4蛋白表达阴性或弱阳性;1NG4基因启动子甲基化阴性的卵巢上皮癌和正常卵巢组织中ING4蛋白表达阳性;在64例1NG4基因启动子甲基化的卵巢上皮癌组织中,ING4蛋白表达强度与ING4基因启动子的甲基化程度呈负相关（r=-0．435,P〈0．05）。卵巢上皮癌组织中,1NG4基因甲基化的阳性率随着手术病理分期和组织学分级的增加而增加（P〈0．05）;卵巢透明细胞癌（55．6％,10／18）和卵巢子宫内膜样癌（59-3％,16／27）中ING4基因甲基化的阳性率显著高于浆液性囊腺癌（33．9％,20／59）和粘液性囊腺癌（39．1％,18／46）（P〈0．05）;ING4基因启动子的甲基化状态与患者的年龄、有无腹水及淋巴结转移均无显著相关性（P〉0．05）。结论：ING4基因启动子的甲基化可能促进了其在卵巢上皮癌组织中的表达失活,进而促进了卵巢上皮癌的生长和分化。     

腺苷酸环化酶3缺失对小鼠主要嗅觉表皮组织内DNA甲基化的影响

腺苷酸环化酶3 (adenylate cyclaseⅢ,AC3)是嗅觉系统中的重要成分,AC3缺失后小鼠的主要嗅觉表皮组织(main olfactory epidermal,MOE)随年龄增长逐渐变薄,MOE内基因表达谱发生改变. DNA甲基化在动物发育、基因表达调控中具有重要作用.为了探讨AC3缺失后小鼠MOE内基因启动子甲基化水平的改变以及对基因表达的影响,本文采用DNA甲基化免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip,MeDIP-chip)筛选AC3缺失小鼠MOE内启动子区甲基化差异表达基因,利用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR,MSP)、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)进一步检测部分甲基化差异基因的DNA甲基化水平改变和表达差异.结果表明,AC3缺失小鼠中有1 978个基因启动子的甲基化水平发生了改变,占总探针数的9%,其中727个基因启动子甲基化水平升高,1 251个甲基化水平降低.功能分析表明,这些启动子甲基化发生改变的基因主要涉及的功能分别与嗅觉受体、神经发育、cAMP信号通路、ATP结合、钙离子调控、乙酰化修饰、转录因子等相关. MSP检测表明,嗅觉受体基因Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr651、Olfr691启动子区的甲基化水平升高,Cngb1、Pde4a和Olfr1394基因启动子区的甲基化水平降低. qRT-PCR结果显示,基因Cngb1、Hcn4、Olfm1、Olfr1394、Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr691的表达水平显著下降,而Pde4a和Olfr651基因的表达水平显著升高.总之,AC3缺失后MOE内嗅觉受体基因、神经发育相关基因、cAMP信号通路等相关基因启动子甲基化水平发生显著改变,影响核苷酸切除修复、DNA复制、错配修复等信号通路的传导,从而综合调控小鼠MOE内的基因表达数量和水平.     

TFF2、ERa和ERβ在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的:研究三叶因子2(Trefoil factors2,TFF2)及雌激素受体ERa,ERβ在子宫内膜癌、子宫内膜不不典型增生及正常子宫内膜组织中的表达并探讨其临床意义。方法:应用免疫组化法对14例正常子宫内膜组织、22例子宫内膜不典型增生及82例子宫内膜癌病例中TFF2,ERa和ERβ的蛋白表达进行检测,观察在不同子宫内膜组织中TFF2,ERa和ERβ蛋白的表达情况。结果:TFF2在正常子宫内膜中的阳性表达率为85.7%(12/14),在不典型增生组织中的阳性表达率72.7%(16/22),在子宫内膜癌中的阳性表达率为57.3%(47/82),TFF2蛋白表达强度在正常、不典型增生和内膜癌组间比较有统计学差异(P<0.05)。TFF2蛋白表达与肿瘤的分化程度,肿瘤的分期和淋巴结转移有关(P<0.05),与浸润程度无关。ERa在正常子宫内膜中的阳性表达率为92.8%(13/14),在不典型增生组织中的阳性表达率为86.4%(19/22),在子宫内膜癌中的阳性表达率为53.7%(44/82),ERa蛋白表达强度在正常,不典型增生和内膜癌组间比较有统计学差异(P<0.05),ERa蛋白表达与肿瘤的分化程度和浸润程度有关(P<0.05),与肿瘤的分期和淋巴结转移无关。ERβ在14例正常子宫内膜组织中ERβ蛋白阳性表达率为78.6%(11/14),在子宫内膜不典型增生中的蛋白阳性表达率为72.7%(16/22),在82例子宫内膜癌组织中ERβ蛋白阳性表达率为48.8%(40/82),ERβ蛋白表达强度在正常、不典型增生和内膜癌组间比较有统计学差异(P<0.05),ERβ蛋白的表达与肿瘤的分化程度、浸润程度有关,与肿瘤的分期和淋巴结转移无关。结论:TFF2、ERa和ERβ在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌中的表达逐渐降低,为进一步研究在子宫内膜癌诊治中的作用提供依据。     

凋亡抑制蛋白Survivin在增生性子宫内膜及子宫内膜癌中的表达

目的　研究凋亡抑制蛋白Survivin在正常子宫内膜、增生性子宫内膜及子宫内膜癌中的表达 ,探讨Survivin蛋白在子宫内膜癌发生发展中的作用及其作为预后判断因子的可行性。方法　应用免疫组织化学S P法 ,检测 15例正常子宫内膜、 2 6例增生性子宫内膜及 33例子宫内膜腺癌中Survivin蛋白的表达 ,并结合临床病理特点进行分析。结果　Sur vivin蛋白的阳性表达率在正常子宫内膜 ,增生性子宫内膜及子宫内膜癌中呈上升趋势。正常子宫内膜仅在增生期有微弱的表达 ,而分泌期及绝经期子宫内膜表达全为阴性 ;而Survivin在子宫内膜癌中及不典型增生中的阳性表达率分别为87 88%和 70 0 % ,均明显高于正常内膜 (P <0 0 5 ) ,且两者的过表达率均高于单纯和复合型增生及正常内膜 (P <0 0 5 ) ,但子宫内膜癌中与不典型增生中的Survivin表达率及过表达率均无明显差异。子宫内膜癌中Survivin的表达强度与组织学分级及手术病理分期明显相关 (P <0 0 5 ) ,但与肌层浸润无关。结论　Survivin作为凋亡相关因子和细胞周期调节因子 ,可能参与了与子宫内膜癌的发生发展 ,其过度表达与预后不良相关 ,其检测可为子宫内膜癌的早期诊断、辅助治疗及预后判断提供理论依据。     

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

MIF和CerbB-2在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的:探讨MIF和Cerb B-2的表达与子宫内膜癌的关系,进一步探讨其表达与子宫内膜癌的发生、发展的关系,为早期诊断子宫内膜癌,判断预后和寻找子宫内膜癌的新的治疗方法奠定基础。方法:应用实时荧光定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测正常子宫内膜、不典型增生和子宫内膜癌组织中MIF m RNA、Cerb B-2 m RNA和MIF蛋白、Cerb B-2蛋白的表达,其中免疫组化中子宫内膜癌组根据临床病理特征,如年龄,临床分期,组织学分级,肌层浸润深度和有无淋巴结转移进行分组。结果:正常子宫内膜、不典型增生内膜和子宫内膜癌组织中都有MIF和Cerb B-2的表达,子宫内膜癌中MIF m RNA和Cerb B-2 m RNA扩增含量显示高水平,其阳性表达率随着病变程度的加重而逐渐升高,差异具有统计学意义(P=0.037);MIF主要表达于子宫内膜腺上皮的细胞质中,少量表达于细胞质,在阳性表达的子宫内膜癌组织中,蛋白含量在I期(P=0.033)、G1期(P=0.034)、无淋巴结转移的组织中水平较高(P=0.041),差异具有统计学意义。Cerb B-2蛋白主要表达在子宫内膜的细胞质,少量在细胞膜中表达,阳性表达率子宫内膜癌不典型增生正常子宫内膜,差异具有统计学意义(P=0.013);Cerb B-2蛋白在III-IV(P=0.009)、G2-3期(P=0.033),有淋巴结转移(P=0.018)的子宫内膜癌中表达含量较高,与年龄和肌层浸润深度无关。结论:MIF和Cerb B-2在正常子宫内膜、不典型增生和子宫内膜癌中都有表达,提示着MIF和Cerb B-2与子宫内膜癌的发生和发展有关,MIF在子宫内膜癌的早期表达含量较高,可以作为子宫内膜癌的早期诊断指标,Cerb B-2在子宫内膜癌的晚期表达含量较高,可以促进肿瘤的侵袭转移,可作为判断疾病的严重程度和预后的指标之一。     

子宫内膜癌C-erbB-2和TTF-1的表达及其与预后的关系

目的:探讨子宫内膜癌组织中C-erbB-2和TTF-1的表达及其与患者临床预后的关系。方法:应用免疫组化S-P法检测正常子宫内膜组织、子宫内膜不典型增生组织、子宫内膜癌组织中C-erbB-2与TTF-1的表达,并分析二者与子宫内膜癌临床病理特征及患者临床预后的关系。结果:子宫内膜癌组织、子宫内膜不典型增生组织、正常子宫内膜组织中C-erbB-2的阳性表达率分别为56.65%、36.67%、16.67%(P0.05),TTF-1的的阳性表达率分别为33.75%、53.33%、70.00%(P0.05)。C-erbB-2的阳性表达与子宫内膜癌的临床病理分期、组织分化、肌层浸润及有无淋巴结转移呈显著正相关(P0.05),与其病理类型无显著相关性(P0.05)。TTF-1的阳性表达与子宫内膜癌的病理分期、组织分化、肌层浸润深度负相关(P0.05),但与有无淋巴结转移及病理类型均无显著相关性(P0.05)。C-erbB-2和TTF-1在子宫内膜癌组织中表达无明显相关性(P=0.303)。子宫内膜癌中C-erbB-2阳性表达者五年生存率(80.90%)显著低于C-erbB-2阴性表达者(93.80%)(P0.05),TTF-1阳性表达者五年生存率(87.70%)略高于TTF-1阴性表达者(85.70%),但差异无统计学意义(P0.05)。结论:子宫内膜癌组织中C-erbB-2的表达显著上调,而TTF-1的表达明显下调,二者表达异常均参与了子宫内膜癌的发生和发展,且C-erbB-2的表达上调与子宫内膜癌患者的不良预后相关。