人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

BCL3基因敲除对线粒体呼吸作用及ATP合成的影响

B淋巴细胞瘤/白血病因子3(B cell CLL/lymphoma 3,BCL3)是一个转录辅调节因子,通过结合转录因子对基因表达起激活或抑制作用,维持细胞存活,但其机制尚不清楚。该研究采用CRISPR/Cas9技术建立BCL3基因敲除的人宫颈癌He La细胞,实时荧光定量PCR和Western blot验证敲除情况。使用特异性荧光探针法、萤火虫荧光素酶法、活细胞能量代谢动态分析法等技术手段检测BCL3基因敲除(BCL3-KO)对细胞内活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、线粒体膜电位、线粒体呼吸作用以及ATP生成的影响。结果发现,BCL3-KO细胞内的相对ROS水平上升约50%,采用转染的方式恢复细胞内表达BCL3基因则可抑制ROS水平的上升;与野生型He La细胞相比,BCL3-KO细胞的线粒体膜电位明显降低(P0.001);BCL3敲除不影响细胞基础有氧呼吸速率,但引起碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙[carbomyl cyanide 4-(trifluorometyocy)phenylhydrazone,FCCP]诱导的最大(极限)呼吸速率显著上升(P0.001);相比野生型细胞,BCL3-KO细胞中的ATP的浓度下降40%。该研究揭示了BCL3对线粒体功能的调控作用,可能是其维护癌细胞存活的原因之一。     

基于数据挖掘分析MTERF2基因在子宫内膜癌的表达及意义

目的:基于数据挖掘分析线粒体转录终止因子2(MTERF2)基因在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况,并进一步探讨MTERF2对子宫内膜癌患者预后的影响。方法:利用Oncomine数据库分析MTERF2基因DNA拷贝数在子宫内膜癌组织中的变化;利用cBioportal分析MTERF2基因在子宫内膜癌组织中的突变情况;通过基因表达谱动态分析(GEPIA)探讨人体正常组织及其相应的肿瘤组织中MTERF2基因的表达差异;经MethHC分析子宫内膜癌和正常子宫内膜组织中MTERF2基因DNA启动子区甲基化水平的差异;利用OncoLnc对MTERF2基因的表达水平与子宫内膜癌患者生存率做Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验;在String-DB数据库中探索MTERF2基因在线粒体DNA表达调控过程中关系密切的相关基因。结果:与正常子宫内膜组织相比,子宫内膜癌组织中MTERF2基因DNA拷贝数无明显变化(P0.05),在mRNA水平呈显著低表达(P0.05),DNA启动子区甲基化水平显著降低(P0.005);MTERF2基因的表达水平与子宫内膜癌患者的总体生存时间无显著相关性(Log-Rank P0.05);TFB1M、TFB2M、POLMT、MTERFD1、MTERFD2、PTCD1、SSBP1、COA3、HDGFRP3等基因与MTERF2基因关系密切,可能存在相互作用。结论:大样本数据挖掘能迅速获取子宫内膜癌组织中MTERF2基因表达的相关信息,为深入探究MTERF2基因在子宫内膜癌发生发展中的作用机制及其预后价值奠定基础。     

MTERF2在人子宫颈癌细胞株中的表达及对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:线粒体转录终止因子2(MTERF2)是线粒体类核的重要组成成分,且参与线粒体基因的表达调控。本研究旨在阐明MTERF2基因在体外培养的人类正常子宫颈上皮细胞株和子宫颈癌细胞株中的表达情况,并进一步探讨MTERF2对子宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用qRT-PCR和Western印迹检测正常子宫颈上皮细胞株(End1/E6E7)和子宫颈癌细胞株(HeLa、SiHa、C-33A、C4-1、CaSki)中MTERF2 mRNA及其蛋白质的表达情况;分别构建MTERF2稳定过表达或下调表达的子宫颈癌HeLa细胞株,通过XTT实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、克隆形成实验和流式细胞术等方法观察MTERF2基因过表达或表达下调对子宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响。结果:MTERF2蛋白及mRNA在子宫颈癌细胞株中的表达水平均低于正常宫颈上皮细胞株。与对照组相比,稳定过表达MTERF2的子宫颈癌HeLa细胞增殖能力下降,同时子宫颈癌HeLa细胞的克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力均显著下降;细胞周期出现G1/S期阻滞,周期蛋白D1和pRb蛋白的表达水平明显下降。下调MTERF2表达的子宫颈癌HeLa细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力均有所增强,且未出现细胞周期阻滞。此外,稳定过表达或下调MTERF2表达对子宫颈癌HeLa细胞凋亡均没有显著影响。结论:MTERF2基因在子宫颈癌细胞株中的表达水平低于正常子宫颈上皮细胞株,且负调控子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭,提示其可能在子宫颈癌发生发展中发挥类似抑癌基因的作用。     

人线粒体RNA加工及调控

线粒体是细胞内氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OXPHOS）和合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的细胞器，是细胞能量代谢的“动力工厂”。线粒体几乎存在于所有真核生物中，参与细胞凋亡、钙稳态以及先天免疫反应的调节等过程，对细胞行使正常的生理功能至关重要。线粒体是半自主细胞器，拥有自身的基因组DNA，编码37个基因，包括2个rRNA基因、13个m RNA基因和22个tRNA基因。线粒体的基因表达需要经过复杂的转录和转录后加工过程，包括多顺反子RNA的切割、RNA的修饰以及RNA的末端加工等过程。异常的线粒体RNA加工会导致线粒体RNA表达谱发生变化、线粒体翻译紊乱、线粒体功能失常等，从而造成多种线粒体相关疾病。本文综述了线粒体DNA的转录、RNA转录后加工以及影响RNA加工的因素方面的最新研究进展。     

低表达线粒体蛋白ISCA2对线粒体功能影响的机制研究

该文探讨了ISCA2蛋白低表达对细胞内铁硫蛋白和能量代谢的影响。在HeLa细胞内将ISCA2基因敲低,通过免疫印迹、顺乌头酸酶胶内酶活性分析法分析线粒体内外铁硫蛋白水平和活性改变;用紫外–可见分光光度法检测细胞线粒体内氧化磷酸化复合体活性;用海马能量分析仪分析细胞内能量代谢的改变。结果表明,ISCA2蛋白低表达后,氧化磷酸化复合体中各铁硫蛋白亚基都出现不同程度的下调,且对于线粒体[4Fe-4S]型铁硫蛋白亚基影响显著,但对线粒体[2Fe-2S]型铁硫蛋白亚基以及胞质[4Fe-4S]型铁硫蛋白亚基影响较小。同时,ISCA2蛋白低表达后对线粒体复合体活性和线粒体能量代谢影响显著,细胞有氧呼吸降低,细胞外乳酸含量增加。这些结果表明,ISCA2蛋白低表达后抑制铁硫簇的组装,导致铁硫蛋白功能障碍,影响线粒体复合体活性和氧化磷酸化系统,使得细胞能量代谢紊乱。     

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。     

细胞增殖相关基因Nek2的表达与宫颈癌发生的相关性研究

[目的]探究细胞增殖过程中中心体分离相关基因Nek2(NIMA-related kinase 2,Nek2)的表达水平以及抑制Nek2对宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响。[方法]采集未经放疗或化疗的正常宫颈组织50例,宫颈癌组织40例,提取标本组织总RNA,实时荧光定量PCR检测Nek2在病样组织中的表达水平,以正常宫颈组织作为对照分析Nek2与宫颈癌发生的相关性。以Nek2 siRNA转染Si Ha、He La和293FT(对照)细胞,CCK-8细胞增殖检测法分析细胞数量和对细胞增殖的抑制率,Transwell小室侵袭和Transwell迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力。[结果]Nek2 mRNA在宫颈癌的相对拷贝数(0.0119±0.00601)极显著高于(P0.01)正常宫颈组织(0.00133±0.00216),上调8.94倍。抑制Nek2的活性可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P0.05),且抑制率显著高于非肿瘤细胞的抑制率。[结论]Nek2在宫颈癌组织中的表达水平显著提高,其通过促进癌细胞增殖、侵袭和迁移来促进肿瘤的发生,可作为宫颈癌治疗的候选靶标。     

线粒体DNA单体型M8a对转线粒体细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)单体型M8a对细胞线粒体能量代谢的影响,该研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导血小板–细胞融合技术,构建mt DNA单体型M8a和G2a转线粒体细胞(transmitochondrial cytoplasmic hybrid cell,cybrid)模型。后续运用Real-time PCR检测细胞mt DNA拷贝数和RNA转录水平,多功能酶标仪检测细胞活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),线粒体呼吸测定仪检测细胞内源性氧呼吸(oxygen consumption,OC)情况。结果表明,与G2a细胞相比,M8a细胞mt DNA拷贝数和线粒体轻链(L链)转录水平明显降低(P0.01),细胞基础耗氧量、ATP合成耗氧量、最大氧呼吸能力和MMP显著下降(P0.05),细胞ROS水平显著上升(P0.05)。mt DNA单体型M8a细胞的线粒体呼吸功能受损,可能增加了该单体型人群罹患2型糖尿病的风险。     

鲍曼不动杆菌Omp34经线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡

[目的]构建鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)外膜蛋白34(outer membrane protein 34,Omp34)的表达载体pcDNA3.1/myc-His-Omp34,研究Omp34引起HeLa细胞凋亡的机制。[方法]PCR扩增目的基因Omp34,将其克隆至载体pcDNA3.1/myc-His;菌液PCR和测序筛选阳性克隆;将pcDNA3.1/myc-His-Omp34转染HeLa细胞;反转录PCR和Western Blot检测Omp34在HeLa细胞中的表达;CCK8实验检测细胞增殖抑制率;JC-1探针检测线粒体跨膜电位;透射电镜观察HeLa细胞线粒体结构,Western Blot鉴定HeLa细胞线粒体凋亡相关蛋白。[结果]成功构建pcDNA3.1/myc-His-Omp34真核表达载体;并且Omp34可抑制HeLa细胞增殖,引起线粒体损伤及跨膜电位崩溃,导致促凋亡蛋白Bax和Bad表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表达降低。[结论]成功构建pcDNA3.1/mycHis-Omp34表达载体,并证明Omp34可经线粒体途径导致HeLa细胞凋亡。     

溴化乙锭诱导无线粒体DNA宫颈癌HeLa细胞系的构建和鉴定

[目的]构建和鉴定由溴化乙锭(EB)诱导的无线粒体DNA(mtDNA)宫颈癌ρ~0HeLa细胞系,探讨mtDNA与宫颈癌发生的关系。[方法]采用含50ng/ml溴化乙锭、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培养基中传代培养HeLa细胞。低剂量EB连续诱导60d后,采用营养缺陷鉴定、PCR和WesternBlot鉴定无mtDNA的ρ~0HeLa细胞系;采用透射电子显微镜观察ρ~0HeLa细胞内线粒体形态变化;采用CCK8法测定ρ~0HeLa细胞增殖曲线。[结果]经溴化乙锭诱导60d,可以培养出具有尿嘧啶核苷依赖性的无mtDNA宫颈癌HeLa细胞系。普通PCR和qPCR结果均显示,低剂量EB诱导60d的ρ~0HeLa细胞中mtDNA完全缺失。WesternBlot结果显示,HeLa细胞中能表达核编码的NDUFA9蛋白,也能表达线粒体编码MT-ND1蛋白。而ρ~0HeLa细胞中已无MT-ND1蛋白表达,但核编码的NDUFA9蛋白能够正常表达。透射电子显微镜观察显示,ρ~0HeLa细胞内部分出现空泡改变,线粒体嵴被破坏。CCK8细胞增殖实验结果显示,ρ~0HeLa细胞系生长速度显著低于正常HeLa细胞系,且差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]无mtDNA的宫颈癌HeLa细胞系的建立,为后续研究mtDNA突变和线粒体功能在宫颈癌发生发展中的作用及机制奠定了基础。     

卵巢癌中线粒体转录终止因子1的表达及其意义

目的:探讨人线粒体转录终止因子1(MTERF1)在卵巢癌中的表达及其在预后判断中的作用。方法:利用Oncomine数据库对比分析卵巢癌和正常卵巢组织中MTERF1基因表达水平;提取10例配对卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织总RNA和蛋白质,real time RT-PCR检测MTERF1 mRNA在各组织中的表达,Western印迹检测MTERF1蛋白在各组织中的表达;利用Kaplan-Meier plotter数据库分析MTERF1表达对卵巢癌患者的预后价值。结果:Oncomine数据库中共收集了8个不同类型的研究结果,荟萃分析显示MTERF1在卵巢癌中表达增高,且差异具有统计学意义(P0.05)。本研究10例卵巢癌及其配对的正常卵巢上皮组织中,有6例卵巢癌中MTERF1 mRNA和蛋白质表达水平增高。Kaplan-Meier plotter数据库分析显示,MTERF1 mRNA表达水平越高,早于2期的卵巢癌患者无进展生存期越短,预后越差(P0.05);但卵巢癌患者的总生存期与MTERF1 mRNA表达水平无相关性(P0.05)。结论:卵巢癌组织中MTERF1 mRNA和蛋白质表达升高;在早期卵巢癌患者中,MTERF1表达水平越高,预后越差,可作为预测卵巢癌患者预后的潜在分子标记物。