一个AA基因组特异的串联重复序列的克隆及其在中国普通野生稻和栽？…

从籼稻“窄叶青”中克隆到了１个重复序列（ｐＯｓ１３９）。经分子杂交证明,ｐＯｓ１３９为一稻属内ＡＡ基因组特异的串联重复序列。序列分析表明,ｐＯｓ１３９以３５５ｂｐ为一重复单位。以ｐＯｓ１３９为探针对２９份中国普通野生稻和４３份中国栽培稻的基因组ＤＮＡ进行的分子杂交表现,籼、粳亚种之间具有明显的差异,籼稻杂交带数明显多于粳稻,普通野生稻与籼稻相似,具有较多的杂交带数。拷贝数测定结果表明,ｐＯｓ１３９     

中国普通野生稻遗传分化的RAPD研究

多数学者已认定亚洲栽培稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）的祖先是普通野生稻（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）。然而栽培稻的籼、粳分化是发生在驯化之前还是在驯化之后,也即普通野生稻是否存在籼、粳分化的问题,是十几年来稻作起源研究中争论的热点之一。Ｓｅｃｏｎｄ［１］用多个同工酶位点的分析结果得出结论,普通野生稻在驯化为栽培稻之前就已经发生了籼、粳分化,即有籼型普通野生稻和粳型普通野生稻之分。Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ和Ｇａｄｒｉｎａｂ［２］用２４个形态和生理性状及１２个同工酶位点和杂交亲合力等方法证明普通野生稻没有发…     

盐酸酸化可改善核抗原免疫荧光染色

免疫荧光染色(immunofluorescent staining, IF)技术广泛用于细胞或组织内抗原定性、定量或定位检测。然而,依常规染色步骤操作,在有些胞核抗原的检测中很难得到令人满意的结果。有研究者采用盐酸酸化预处理用于细胞增殖标记物5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)的荧光染色并获得良好效果。但此方法是否也适用于其他类型的胞核抗原,尚不清楚。为系统全面分析盐酸酸化在胞核抗原免疫荧光染色中的作用,本文以成年C57BL小鼠主要嗅觉表皮(MOE)为材料,分别对Ki-67、5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)三种不同类型的胞核抗原进行盐酸酸化处理免疫荧光染色。结果显示,当血清封闭和抗体浓度等条件一致时,室温下盐酸酸化2 h,Ki-67的染色效果最佳,而阴性对照与未酸化组均未出现阳性信号;同样经过盐酸处理2 h,5mC和5hmC染色也呈现较强的阳性信号。该研究表明,在一些胞核抗原免疫荧光染色中,使用盐酸酸化处理可显著提高染色效果。     

腺苷酸环化酶3缺失对小鼠主要嗅觉表皮组织内相关因子及信号通路的影响

主要嗅觉表皮(main olfactory epithelium, MOE)是哺乳动物感知气味分子的主要嗅觉器官。在MOE组织内,大多数嗅觉神经元通过cAMP信号传导通路感知气味信息。作为嗅觉cAMP信号通路的主要成员之一,腺苷酸环化酶3（adenylyl cyclase 3, ac3）基因敲除小鼠嗅觉探测功能丧失。除cAMP信号传导通路外,MOE内AC3相关因子AC2和AC4,以及肌醇1,4,5-三磷酸（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）信号通路和Sonic Hedgehog（Shh）信号通路均有表达。然而,敲除ac3是否会对ac2和ac4以及IP3和Shh信号通路成员产生影响,尚不清楚。本文以AC3缺失（AC3-/-）及其野生型小鼠（AC3+/+）MOE为材料,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫荧光组织化学方法,发现AC3缺失后,MOE内的ac2和ac4,以及IP3信号通路中的IP3受体ip3r1及钙调蛋白calm1和calm2表达水平均明显降低。Shh信号通路中的受体patched(ptch)与smoothened(smo)、以及核转录因子gli1与gli2的表达也受到了影响。总之,AC3基因缺失不但导致小鼠MOE组织中cAMP信号通路受损,同时AC3相关因子,IP3信号通路和Shh信号通路的传导也受到抑制。本文对于阐明AC3基因敲除小鼠嗅觉丧失的原因及其嗅觉探测机制具有重要启示作用。     

谷子光敏色素基因光周期、非生物胁迫响应特性及关键自然变异位点鉴定北大核心CSCD

比较分析光敏色素基因家族成员对光周期、非生物胁迫响应模式并鉴定其有利自然变异类型,为全面了解光敏色素基因家族在光周期调控谷子生长发育及应对非生物胁迫中的作用机制、开展关键性状的分子辅助选择奠定基础。文中利用RT-PCR技术从超晚熟谷子农家种‘毛粟’中克隆了3个光敏色素基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC;在进行生物信息学分析后,利用荧光定量PCR技术研究了3个基因的光周期调控模式及对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)模拟干旱、自然干旱、脱落酸(abscisic acid,ABA)、高温、Na Cl五种非生物胁迫的响应特性;最后检测这3个基因在160份谷子材料的突变位点,通过单倍型分析确定基因的功能效应。结果表明,获得了基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC包含完整编码区的c DNA序列,长度分别为3 981、3 953、3 764 bp,其中基因SiPHYB和SiPHYC具有较近的进化关系。基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC均受光周期调控,但光周期对SiPHYB、SiPHYC昼夜表达模式的影响要强于SiPHYA;短日照条件临近抽穗SiPHYA、SiPHYB表达水平显著低于长日照,暗示其在谷子长日照抑制抽穗中发挥作用。SiPHYB和SiPHYC共同响应PEG模拟干旱、自然干旱、ABA、高温4种胁迫;SiPHYA和SiPHYB以不同方式响应盐胁迫,SiPHYC没有参与谷子盐胁迫响应过程。基于160份谷子材料重测序数据发现基因SiPHYB高度保守,基因SiPHYA含有两个错义突变:单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP) 7 034 522;,SNP7 036 657;,导致延迟抽穗、增加株高。基因SiPHYC含有一个错义突变(SNP5 414 823;),导致短日照缩短抽穗期,长日照延长抽穗期,对株高、穗长的增加作用不受光温环境影响。光周期对基因SiPHYA、SiPHYB和SiPHYC具有不同的调控作用,除了盐胁迫,SiPHYB和SiPHYC共同响应多种非生物胁迫,相比参考基因型,SiPHYA、SiPHYC突变延迟抽穗、增加株高和穗长。     

高通量质谱法用于小鼠器官内源性肽的鉴定

内源性肽以细胞因子、生长激素、激素肽等形式在人体的内分泌、神经、细胞生长和生殖各个领域发挥功能。神经肽是一种内源性肽,与痛觉、睡眠、情绪、学习与记忆等生理活动相关,不但存在于脑部神经细胞,也存在于其他体液和器官内并发挥重要作用。目前对器官内源性肽的研究仍不足,尤其是其中的神经肽。文中应用液质联用串联质谱高通量鉴定胰腺、心脏、肝脏和肾脏中内源性肽的分布以及神经肽的种类。鉴定结果显示,在肝脏中内源性肽和神经肽的数目最多,而胰腺中最少;所鉴定到的内源性肽具有器官特异性,在4个器官中分别呈现不同的动态分布;4个器官中神经肽的LPV(最长肽变异体)数目差异较大,而且基因家族的分布也各不相同,比如胰腺中的神经肽多属于Glucagon家族,心脏中的神经肽分别属于ACBD7、Granins、PEBP等几个家族。鉴定结果将为疾病的机制研究和治疗药物的研发提供参考。     

腺苷酸环化酶3缺失对小鼠主要嗅觉表皮组织内DNA甲基化的影响

腺苷酸环化酶3 (adenylate cyclaseⅢ,AC3)是嗅觉系统中的重要成分,AC3缺失后小鼠的主要嗅觉表皮组织(main olfactory epidermal,MOE)随年龄增长逐渐变薄,MOE内基因表达谱发生改变. DNA甲基化在动物发育、基因表达调控中具有重要作用.为了探讨AC3缺失后小鼠MOE内基因启动子甲基化水平的改变以及对基因表达的影响,本文采用DNA甲基化免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip,MeDIP-chip)筛选AC3缺失小鼠MOE内启动子区甲基化差异表达基因,利用甲基化特异PCR (methylation-specific PCR,MSP)、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)进一步检测部分甲基化差异基因的DNA甲基化水平改变和表达差异.结果表明,AC3缺失小鼠中有1 978个基因启动子的甲基化水平发生了改变,占总探针数的9%,其中727个基因启动子甲基化水平升高,1 251个甲基化水平降低.功能分析表明,这些启动子甲基化发生改变的基因主要涉及的功能分别与嗅觉受体、神经发育、cAMP信号通路、ATP结合、钙离子调控、乙酰化修饰、转录因子等相关. MSP检测表明,嗅觉受体基因Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr651、Olfr691启动子区的甲基化水平升高,Cngb1、Pde4a和Olfr1394基因启动子区的甲基化水平降低. qRT-PCR结果显示,基因Cngb1、Hcn4、Olfm1、Olfr1394、Olfr1153、Olfr231、Olfr378、Olfr691的表达水平显著下降,而Pde4a和Olfr651基因的表达水平显著升高.总之,AC3缺失后MOE内嗅觉受体基因、神经发育相关基因、cAMP信号通路等相关基因启动子甲基化水平发生显著改变,影响核苷酸切除修复、DNA复制、错配修复等信号通路的传导,从而综合调控小鼠MOE内的基因表达数量和水平.     

SRFA法构建水稻DNA指纹图谱

RAPD用于生物鉴定具有快速、简便、经济等优点。但是,由于该法所用引物通常为9－10个寡聚核苷酸,与PCR使用特异引物相比,其Tm值相对较低,扩增反应易受外界条件影响,重复性较差。SRFA技术采用设计有限制内切酶位点的人工合成接头与引物互补,弥补了RAPD法的上述不足。Fig.1为SRFA的技术路线。为提高连接效率,在同一试管内,用PstI酶解基因组DNA,并与人工接头连结,制备SRFA扩增的模板。合成与接头序列相应的引物。对5上野生稻品种和籼、粳稻各一个栽培品种SRFA刊物放增。Fig.2表示：每种材料均能获得约10条以得一条（1．3kb）片段,用引物2可得2条（1．1kb、0．7kb）片段。与FAPD法相比,SRFA法增加20％的多态性。栽培稻与野生稻之间在多态性没有差异,说明两乾亲缘关系非常接近。五种野生稻的图谱可分为两类：江西、湖南、广西的与籼稻相近,广东、云南的与粳稻相近。当然,这还有待其它方面的研究来验证。接头的设计要求避免自身连续,与目的的自然连续后不能再被PstI切开。引物包括不变序列和选择序列两部分,前者与接头互补,后者为数个隋机序列。因此,SRFA法除了重复性好以外,还可通过增加（或减少）选择序列的数目扩增较少（或多）的产物片段,满足不同的需要。每一对设计有不同限制酶切位点的接头和引物可扩增出一个特异的DNA指纹图谱,与RAPD法相比,SRFA法操作稍显繁琐,模板DNA用量大、质量要求高,由于酶切和连续,成本也相对较高。     

Construction of Rice DNA Finger Print by SRFA

ＲＡＰＤ用于生物鉴定具有快速、简便、经济等优点。但是,由于该法所用引物通常为９～１０个寡聚核苷酸,与ＰＣＲ使用特异引物相比,其Ｔｍ值相对较低,扩增反应易受外界条件影响,重复性较差。ＳＲＦＡ技术采用设计有限制内切酶位点的人工合成接头与引物互补,弥补了ＲＡＰＤ法的上述不足。Ｆｉｇ．１为ＳＲＦＡ的技术路线。为提高连接效率,在同一试管内,用ＰｓｔＩ酶解基因组ＤＮＡ,并与人工接头连结,制备ＳＲＦＡ扩增的模板。合成与接头序列相应的引物。对南方５个野生稻品种和籼、粳稻各一个栽培品种进行ＳＲＦＡ扩增。Ｆｉｇ．２表示：每种材料均能获得约１０条以上的扩增条带。条带的大小在４００２０００ｂｐ之间。栽培稻品种中出现多态性片段：用引物１可得一条（１．３ｋｂ）片段,用引物２可得２条（１．１ｋｂ、０．７ｋｂ）片段。与ＦＡＰＤ法相比,ＳＲＦＡ法增加２０％的多态性。栽培稻与野生稻之间在多态性上没有差异,说明两者亲缘关系非常接近。五种野生稻的图谱可分为两类：江西、湖南、广西的与籼稻相近,广东、云南的与粳稻相近。当然,这还有待其它方面的研究来验证。接头的设计要求避免自身连结,与目的片段连结后不能再被ＰｓｔＩ切开。引物包括不变序列和选择序列两部     

腺苷酸环化酶3缺失下调小鼠嗅觉受体基因表达北大核心CSCD

主要嗅觉表皮组织(MOE)是哺乳动物感知气味分子的重要器官,气味诱导是嗅觉受体神经元(ORN)活动的起点,嗅觉受体(OR)结合气味分子后通过环腺苷酸(c AMP)信号通路向下游传递信号。腺苷酸环化酶3(AC3)是此通路中的重要分子。为了探讨AC3缺失对小鼠MOE内ORs基因表达的影响,本文以AC3敲除型小鼠(AC3-/-)和野生型小鼠(AC3+/+)为材料,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)技术分析了部分ORs基因及与其相关因子在MOE中的表达。qRT-PCR表明,3月龄AC3-/-小鼠MOE中嗅觉受体Olfr15、Olfr16、Olfr533、Olfr536、Olfr1507和Olfr642的表达量均显著下降。出生后PND7、PND30和PND90三个不同发育时期的AC3-/-小鼠MOE原位杂交显示,嗅觉受体Olfr15、Olfr536和Olfr1507表达的细胞数目均减少。进一步qRTPCR分析发现,3月龄AC3-/-小鼠嗅觉受体相关因子Rtp1、Rtp2、Reep1、Lhx2、Emx2和Ric-8b的表达也均发生显著下调。由此推测,AC3缺失导致的ORs及其相关因子的表达下调可能是嗅觉行为障碍的原因之一。