黄河裸裂尻鱼肥胖基因克隆及其对青藏高原季节性冷环境的适应性表达

目的克隆黄河裸裂尻鱼肥胖基因(obese gene,ob),分析编码蛋白leptin的序列特征,检测ob mR-NA的组织特异性表达和不同环境温度下肝胰脏和白肌ob mRNA的相对表达水平,为探究黄河裸裂尻鱼在青藏高原季节性寒冷环境下的生态适应机制提供科学数据。方法利用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得ob基因全长cDNA序列。通过已知cDNA序列设计半定量RT-PCR和real-time PCR引物,进行表达研究。结果黄河裸裂尻鱼ob基因序列全长为1 337 bp,其中开放阅读框(ORF)长513 bp,编码170个氨基酸。黄河裸裂尻鱼ob mRNA在心脏、肾脏、脂肪、肠、精巢、肝胰脏、鳃、脑和肌肉9个被检组织中均有表达,其中在心脏中表达最强,肌肉组织中表达最弱。栖息水域环境温度下降,将显著抑制黄河裸裂尻鱼肝胰脏和白肌ob mRNA的表达。结论黄河裸裂尻鱼ob基因特殊的组织表达特征可能与其特定组织的能量代谢及其特殊的生物学功能有关。Leptin在黄河裸裂尻鱼能量代谢调节和季节性环境适应方面发挥着重要作用。     

黄河裸裂尻鱼肌酸激酶M-CK cDNA的克隆及组织表达分析

肌酸激酶(CK)能够催化磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之间的可逆性转移,在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)肌酸激酶基因全长c DNA序列,并进行了生物信息学分析和系统发育关系研究。黄河裸裂尻鱼肌酸激酶c DNA全长1 599 bp,开放阅读框(ORF)1 143 bp,编码380个氨基酸,具有典型的N-端结构域和C-端催化结构域。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio)M3-CK有较高的同源性,其序列一致度达94%以上。系统发育分析显示,黄河裸裂尻鱼肌酸激酶与斑马鱼和鲤的M3-CK聚在一支,形成一个单系群,初步判定克隆获得的黄河裸裂尻鱼肌酸激酶基因可能与鲤和斑马鱼M3-CK是直系同源基因。利用Real-time PCR方法检测和分析了黄河裸裂尻鱼主要组织肌酸激酶m RNA表达水平,肌肉、肠、眼、心中肌酸激酶转录本表达较高,在肝胰脏和脑中表达微弱。肌酸激酶在肌肉、肠、和心中高表达与其能量代谢功能相适应,而在眼组织中的高表达是否与肌酸激酶的其他功能相关,有待于进一步研究。     

黄河裸裂尻鱼MSTN基因RNA干扰研究

目的利用反义寡合甘酸技术抑制肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)的表达,评估MSTN基因的沉默效果,并检测RNA干扰后对下游基因的影响。方法通过构建黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)MSTN基因RNA干扰(RNAi)重组腺病毒载体1P3(DSP MSTN 273+250+1737)和1P2(DSP MSTN 195+1670),并将其注射黄河裸裂尻鱼肌肉组织,进行活体RNA干扰;利用real-time PCR和Western blotting评估MSTN基因的沉默效果,并检测MSTN基因RNA干扰后肌肉肌酸激酶(muscle-type creatine kinase,M-CK)基因转录水平的调控作用。结果real-time PCR分析结果表明,与HK组(病毒通用阴性对照组)和N组(空白对照组)相比,重组腺病毒载体1P3对黄河裸裂尻鱼肌肉MSTN基因的转录具有明显的干扰作用(P0.05),抑制率达53.5%;而重组腺病毒载体1P2对MSTN基因的转录无明显干扰作用(P0.05)。Western-blotting分析结果与real-time PCR结果相一致。同时,经1P3干扰后随着MSTN基因转录水平的下降,其肌肉肌酸激酶M-CK基因表达水平显著上升。结论通过RNAi技术能够有效的抑制MSTN基因的表达,并能够上调M-CK基因的表达量。因此,证明了在黄河裸裂尻鱼中MSTN能够抑制M-CK的转录。揭示高原土著鱼类MSTN基因的对肌肉的生长发育起到调控作用。     

松江鲈肌肉生长抑制素基因克隆和序列特征分析

肌肉生长抑制素(myostatin)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子.该研究以松江鲈肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR、5'-RACE和3'-RACE的方法,获得了松江鲈MSTN基因的3个片段,测序后拼接得到2568 bp全长cDNA序列,其包含了1131个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码376个氨基酸.松江鲈MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RARR和10个保守的半胱氨酸残基:核苷酸和氨基酸同源性分析发现,松江鲈MSTN基因序列与石首鱼、条纹狼鲈、美洲白鲈、金眼石鮨等同源性较高;与哺乳动物和鸟类同源性较低.系统发育分析表明,松江鲈MSTN与石首鱼亲缘关系最近.RT-PCR分析表明,该基因在肌肉表达量最高;在肠中也有较高表达:在脑和肿脏中也能检测到表达.此结果表明,松江鲈MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能.     

利用Cyt b基因序列探讨柴达木裸裂尻鱼的分类学地位

长期以来,柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)的分类学地位存在争议。为此,测定了柴达木裸裂尻鱼格尔木河及托素湖种群24个个体及黄河裸裂尻鱼(S.pylzovi)黄河及大通北川河种群12个个体的Cytb基因全序列。通过遗传距离和系统发育分析,探讨了柴达木裸裂尻鱼的分类学地位。结果显示,柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼在系统进化树上并未形成相应的单系群;柴达木裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼种间平均遗传距离为0.54%,明显低于裂腹鱼亚科其他属鱼类的种间遗传距离及本属其他种间遗传距离,表明来自柴达木盆地格尔木河和托素湖的裸裂尻鱼与黄河裸裂尻鱼之间没有达到种级水平的显著分化。综合地质学资料和柴达木水系与黄河水系现今的隔离格局,建议将柴达木裸裂尻鱼作为黄河裸裂尻鱼的一个亚种,即S.pylzovi kessleri。     

鳜肌肉生长抑制素Myostatin cDNA克隆与组织表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜(Siniperca chuatsi)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)cDNA序列,并分析了该基因的结构特征和亲缘关系。鳜MSTN cDNA序列全长2627bp,包括5′端非翻译区117bp、3′端非翻译区1376bp和开放阅读框(ORF)1134bp,共编码377个氨基酸,含22个氨基酸的信号肽。鳜MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析表明,鳜与其他鱼类聚为一支。RT-PCR分析表明,鳜MSTN在成体不同组织中的表达情况不同,其中,卵巢、肾、眼、肌肉、心、脑、皮肤和胃中有表达,肝胰脏未见表达。     

草鱼与鲢鱼肥胖基因克隆与序列分析

肥胖基因产物leptin是调节哺乳动物摄食、能量代谢等生命活动的重要细胞因子。 应用RT-PCR和RACE法获得了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix) leptin基因的全长cDNA序列分别为1 096 bp和1 176 bp,编码173和172个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,草鱼和鲢鱼的leptin序列与其它鲤科鱼类leptin的同源性较高,而与其他鱼类的leptin同源性很低,但所有鱼类的leptin均含有用于形成二硫键的高度保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼和鲢鱼leptin与其他鱼类leptin聚于一进化分支。应用PCR和Genome Walker方法,进一步获得了草鱼和鲢鱼leptin基因的内含子和5′侧翼区序列。结果表明,获得的草鱼和鲢鱼leptin基因长度分别为2 129 bp和2 192 bp,含有与其他脊椎动物leptin相似的基因结构（含三个外显子和两个内含子）。本研究为深入研究鱼类肥胖基因结构功能关系与鱼类抗肥胖品系定向遗传选育奠定了良好的基础。     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

草鱼MyoD基因内含子和启动子的克隆与分析

本研究采用PCR和染色体步移法克隆了草鱼Myo D基因311 bp的内含子1、125 bp的内含子2及长1 066 bp的部分上游启动子序列。同源性比对分析表明,草鱼Myo D的内含子1与鲤科鱼类的同源性相对较高(87%~97.1%)。生物信息学方法预测草鱼Myo D的启动子序列中发现含有1个核心启动子序列,存在CREB、SP1、ATF等多种与转录诱导调控有关的转录因子结合位点,未发现Cp G岛。草鱼Myo D基因内含子及启动子克隆与特征分析,将为进一步研究鱼类Myo D基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

黄河裸裂尻鱼群体遗传结构和Cyt b序列变异

测定了来自黄河上游和柴达木盆地托索湖的裸裂尻鱼共16个个体的Cytb基因全序列(1141bp),探讨了种群结构和遗传多样性。用MEGA2.1软件分析了碱基组成和序列变异;以青海湖裸鲤、花斑裸鲤和极边扁咽齿鱼为外类群,用PAUP*4.0b10程序构建了单倍型NJ树;用Arlequin Ver.2000程序计算了群体间遗传变异值(Fst)和Nm值以及群体分化概率值。结果显示,来自柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼没有形成单系群,Fst=0.204(P0.05),Nm=1.95。初步判断,黄河和柴达木水系托索湖的裸裂尻鱼未显著分化,支持将柴达木裸裂尻鱼(Schizopygopsis kessleri)归并入黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)的形态学结果。两种群核苷酸多样度()分别为0.0012和0.0026,表现为较低水平。根据校正的分子钟推测,黄河和托索湖裸裂尻鱼群体分歧时间为距今7万年左右的更新世末期,结合地理分布的资料和古地质事件,对黄河裸裂尻鱼群体分布水系间的历史联系进行了分析。