甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得甘蔗MYB2基因,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:甘蔗MYB2基因全长991bp,包含570bp的ORF,编码189个氨基酸。甘蔗MYB2基因包含有MYB功能域,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与玉米等其它植物的MYB2基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ的电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆方法获得葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ(ADHⅢ),并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明,葡萄ADHⅢ基因全长1 602 bp,包含1 140 bp的ORF,编码379个氨基酸,该蛋白不具有明显的疏水区域,也无跨膜结构域,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要构件.葡萄ADHⅢ包含有ADH功能域,和其他植物的ADHⅢ在序列组成、高级结构及活性位点等方面均具有高度的相似性.     

茶树CsIDI1和CsIDI2基因的克隆及其表达分析

该研究在茶树转录组测序基础上,以铁观音品种茶树为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)的2个编码基因(CsIDI1和CsIDI2)的cDNA全长序列。CsIDI1的全长为1 378bp,其开放阅读框(ORF)长度894bp,编码297个氨基酸,亚细胞定位预测位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄IDI的相似性达95%;CsIDI2的全长为1 216bp,其ORF长度为717bp,编码238个氨基酸,亚细胞定位预测位于细胞质上,其氨基酸序列与芝麻IDI相似性达96%。CsIDI1和CsIDI2均含有典型的NUDIX水解酶域。荧光定量PCR结果表明,CsIDI1和CsIDI2基因在茶树地上部不同组织都有表达,但CsIDI2的表达量相对较高;品种间表达量分析显示,它们在父本黄旦品种及杂交后代高香型乌龙茶品种中的表达量显著高于母本铁观音品种,表现出香气上的杂种优势;在乌龙茶做青过程中,随着摇青的进行,CsIDI2的表达被显著诱导,表明CsIDIs在茶叶萜类香气物质形成中发挥重要功能。     

油菜蔗糖转化酶基因的电子克隆和生物信息学分析

运用电子克隆技术获得油菜中一个蔗糖转化酶基因eDNA序列,同时根据此段序列设计引物以油菜eDNA为模板进行扩增。经测序得到证实。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性／亲水性、二级结构、亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明：该基因eDNA序列长度为2150bp,包含一个1779bp开放阅读框,编码592个氨基酸;该编码蛋白含有蔗糖转化酶的多个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥等植物的蔗糖转化酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为蔗糖蛋白酶。研究结果为该基因进一步的实验克隆,表达分析,功能鉴定奠定基础。     

大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因的电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆方法获得大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因(IPI)的cDNA序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的一般理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明,大豆异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长1384bp,包含一个906bp的ORF,编码301个氨基酸。大豆IPI酶为一亲水性的非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲是其主要的二级结构,该酶定位于叶绿体。     

重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析

利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。     

喜盐鸢尾Na~+/H~+逆转运蛋白基因IhNHX1的克隆及序列分析

采用同源克隆和RACE法克隆获得喜盐鸢尾(Iris halophila Pall.)Na+/H+逆转运蛋白基因IhNHX1的全长序列,该基因序列的全长为1 946 bp,包含1个长度为1 611 bp的开放阅读框(ORF),编码537个氨基酸。序列对比及系统树分析结果表明:IhNHX1基因编码的氨基酸序列与另外11种植物NHX1基因编码的氨基酸序列的一致性高达96.2%,相同序列占61.7%,表明该氨基酸序列保守性较高;在系统树上喜盐鸢尾与其他植物的分支长均大于1.2,表明它们的亲缘关系均较远;IhNHX1基因编码的氨基酸序列含有2个保守结构域,即氨氯吡嗪结合位点和CaM结合结构域,分别是NHX1蛋白的标志性结合位点和重要调节区域。该蛋白质的二级结构和跨膜结构域分析结果表明:在IhNHX1基因编码的蛋白质的二级结构中,α螺旋占48.60%、不规则卷曲占32.03%、延伸链占14.71%、氢键转角占4.66%;该蛋白质含有10个跨膜结构域。此外,对5’RACE方法中5’端正向引物的优化设计步骤进行了归纳,以提高PCR扩增的特异性。     

牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的扩增与生物信息学分析

旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的编码基因,并预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白OmpH基因进行PCR扩增及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1 478 bp,ORF包含1 002 bp编码333个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、2个糖基化位点。     

砀山酥梨果实苯丙氨酸解氨酶基因cDNA克隆及序列分析

为了研究梨石细胞形成与木质素合成的关系,以砀山酥梨果实为材料,通过基于同源性的RT—PCR方法,克隆木质素合成途径中的关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因。同时利用基因数据库资料对克隆的PAL序列进行比较分析。结果表明,从砀山酥梨果实中克隆的PAL基因eDNA片段长度为585bp,推断其编码195个氨基酸序列。该序列包含与其它植物PAL相同的活性催化位点,经序列分析和同源性比对,该氨基酸序列与其它植物PAL氨基酸序列的同源性在90％以上。系统进化树分析表明,砀山酥梨PAL氨基酸序列与蔷薇科的甜樱桃PAL氨基酸序列聚类关系最近。     

齿肋赤藓早期光诱导蛋白ELIPs的生物信息学分析

从齿肋赤藓转录组数据库出发,共得到39条注释的早期光诱导蛋白Sc ELIPs unigene,其中2条(Sc ELIP1与Sc ELIP2)具有完整ORF。利用多种生物信息学分析工具,对这2条Sc ELIPs序列的同源性、理化性质、保守域、信号肽、疏水性、亚细胞定位、二级结构、跨膜结构、三维结构、活性位点等方面进行分析。结果表明:2条Sc ELIPs序列的ORF全长分别为711 bp和624 bp,分别编码236和207个氨基酸,二者都具有完整的Chloroa_b-bind功能域,定位于叶绿体类囊体膜,含有3个跨膜α螺旋,第1、3螺旋通过Glu和Arg残基形成双重对称结构,且具有至少4个叶绿素结合活性位点。通过对得到的2条Sc ELIPs进行氨基酸序列比对及基因树分析,得出Sc ELIP1与小立碗藓、山墙藓及盐生杜氏藻聚为一支,而Sc ELIP2与高等植物聚为一支,表现出ELIP从低等到高等植物的进化特征。本研究为Sc ELIPs基因后续的克隆和功能研究奠定了基础。     

球孢白僵菌tps2基因的克隆和生物信息学分析

运用SMART RACE RT-PCR技术与DNA步移技术,首次从球孢白僵菌中克隆出完整的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶TPS2的基因编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长3219 bp,其中开放阅读框（ORF）2619 bp,编码872个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为97.8 kD,理论等电点为6.32。编码框结构基因的全长为2821 bp,有两个长度分别为140 bp和62 bp的内含子。分析表明,上游序列中含有TATA-box、CAAT-box和GC-box,并且也存在GATA元件等启动子顺式调控元件。本文结果将为进一步研究海藻糖在虫生真菌中的生理合成以及抗逆调控机制奠定坚实的基础。     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSUS1的克隆及其表达模式分析

蔗糖合酶（sucrose synthase）与植物库强调节、次生壁的形成和纤维素合成等有着密切的联系,其中在纤维素合成过程中的作用尤为显著。本研究根据我们已获得的毛白杨PtSUS1基因片段设计引物,采用RACE技术,获得了毛白杨PtSUS1的基因序列,测序结果显示该基因序列全长为2 669 bp,包括一个完整的阅读框,编码805个氨基酸。通过Blast检索分析表明,PtSUS1与拟南芥、巨桉、陆地棉、温州蜜柑、毛果杨SUS1的核酸和氨基酸序列的同源性分别达到76%~97%和82%~97%。运用生物信息软件对PtSUS1编码的蛋白进行了二级结构预测和功能位点分析,结果显示该蛋白氨基酸序列包括两个功能域,存在可能的磷酸化位点38个,无跨膜结构域存在。系统进化分析表明PtSUS1与PtSUS2关系最为接近。RT-PCR分析结果显示,PtSUS1在被检测的毛白杨根、茎、叶及雌雄花芽组织和器官中均有表达,呈现组成型表达模式。该研究为进一步深入探索毛白杨蔗糖合酶基因PtSUS1的功能奠定了基础。     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

杨柳田头菇B交配型基因信息素受体片段的克隆与分析

利用简并PCR及DNA步移法,从杨柳田头菇Agrocybe salicacola YAASM0711菌株中扩增得到了一个4 231 bp的核酸片段.经过比对及序列预测,所获得序列中含有杨柳田头菇交配型编码基因中的信息素受体部分,其序列长度为1194 bp,包含4个内含子,5个外显子的长度分别为217 bp,113 bp,67 bp,138bp,449 bp.拼接后的ORF全长984 bp,编码327个氨基酸残基.该序列与灰盖鬼伞Coprinus cinerea、双色蜡蘑Laccaria bicolor信息素受体氨基酸序列较为相似,含有7个跨膜区.信息素受体遗传进化分析显示,其与多个物种信息素受体聚集在一起,可能与真菌信息素受体的多种起源有关.     

家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测

金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。本研究根据EST序列信息,利用RACE技术克隆到1条家蝇Musca domestica金属硫蛋白基因MdMtn（GenBank登录号为GU289398）。序列分析表明,MdMtn cDNA全长408 bp,包含1个123 bp的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈-C-X-C-方式排列。此蛋白理论分子量为3.8 kD,等电点为878。为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了pET-DsbA-MT表达载体,并转化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行融合表达。研究发现MT重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示MdMtn基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。     

茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析

利用RT-PCR及cDNA末端快速扩增法,获得了完整的茶树细胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)基因Cs-cMDH(GonBank登录号为GQ845406).该基因全长1 235 bp,编码332个氨基酸,分子量约为35.5kD.含重组质粒pGEX-MDH的E.coli Rosetta经0.5 mmol·L~(-1) IPTG于32℃诱导3 h后可以获得大量可溶性的61.5 kD融合蛋白.NCBI的BLAST结果显示,Cs-cMDH与高等植物cMDH的氨基酸序列一致性高达88%～93%.通过基于蛋白质结构的多序列比对,预测Cs-cMDH为二聚体,每个亚基包含13个β-折叠及13个a-螺旋.Cs-cMDH包含典型的MDH"指纹"(fingerprint)序列G~(12)AAGQIG~(18),其氨基酸残基D43在所有NAD-MDH中都很保守.Cs-cMDH还包含一些与其它NAD-MDHs同源的保守序列单元,如NAD+结合位点、催化模体及底物结合位点.而且Cs-cMDH还包含在所有植物NAD-cMDHs中都相当保守的6个Cys,因此我们推断Cs-cMDH为茶树细胞质NAD-MDH.茶树基础代谢相关基因cMDH的克隆和原核表达为Cs-cMDH的功能研究奠定了基础.     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。     

彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因SsLRP的克隆和分析

根据彩叶草叶片小型EST库中一条具有1个富亮氨酸重复（leucine-rich repeat,LRR）结构域的EST序列,采用RACE与文库结合的方法,克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA,SsLRP（LRR-Related Protein）（GenBank登录号FJ787729）。SsLRP cDNA全长1024bp,包含一个657bp的ORF框,编码218个氨基酸。其5’-UTR区含有2个终止子TAG,3’-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域,具有5个保守的LRR结构域,多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明,SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级结构预测表明,SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关,推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-PCR分析表明,SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式,在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达,在受菌核病感染植株的茎和叶中表达上调。     

Using bacteria to analyze sequences involved in chloroplast gene expression

The complete nucleotide sequence of chloroplast DNA from a liverwort, Marchantia polymorpha has made clear the entire gene organization of the chloroplast genome. Quite a few genes encoding components of photosynthesis and protein synthesis machinery have been identified by comparative computer analysis. Other genes involved in photosynthesis, respiratory electron transport, and membrane-associated transport in chloroplasts were predicted by the amino acid sequence homology and secondary structure of gene products. Thirty-three open reading frames in the liverwort chloroplast genome remain unidentified. However, most of these open reading frames are also conserved in the chloroplast genomes of two species, a liverwort, Marchantia polymorpha, and tobacco, Nicotiana tabacum, indicating their active functions in chloroplasts.Abbreviations bp base pair - kDa kilodalton - IR inverted repeat - ORF open reading frame - DALA -aminolevulinate