不同抗原修复方法对肝癌组织中内源性生物素的影响及对策

目的探讨不同抗原修复方法对肝癌组织中内源性生物素的影响以及消除办法.方法采用pH6.0、pH8.0及pH9.0不同pH值的抗原修复液进行修复,对30例经甲醛固定石蜡包埋的肝细胞癌组织中内源性生物素活性进行检测,并通过不同检测方法对30例肝细胞癌中AFP(Alpha Fetoprotein)染色结果进行对比.结果加热抗原修复暴露肝细胞癌组织中内源性生物素的活性.不同pH值抗原修复液对内源性生物素的活性影响各不相同,阳性强度随着pH值增高而增强.生物素阻断剂能有效阻断内源性生物素的活性.采用pH9.0Tris-EDTA进行修复加Envision检测系统可提高肝癌组织中AFP的阳性率及阳性强度.结论加热抗原修复可使被甲醛封闭的内源性生物素的活性重新暴露,对免疫组化的染色结果造成影响,生物素阻断系统是消除内源性生物素的有效方法,采用pH9.0的抗原修复液进行修复加Envision非生物素检测系统是免疫组化染色中较为理想的检测方法.     

两种甲型肝炎病毒抗原快速检测方法的建立

目的建立两种甲型肝炎病毒抗原(HAV-Ag)检测试剂盒,并对其检测效果进行评价。方法生物素标记甲型肝炎病毒抗体(HAV-Ab)与辣根过氧化物酶标记亲和素联合应用建立甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法;同时使用辣根过氧化物酶标记HAV-Ab作放大系统建立双抗体夹心甲型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂,对比两种检测方法的特异性、灵敏度及实际应用效果。结果用生物素标记甲型肝炎病毒抗体-辣根过氧化物酶标记亲和素作放大系统建立的甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法,较双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度高1～2个稀释度;两种检测法均对10余种病毒无交叉,P/N值BA-ELISA检测法较高。结论甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法是一种灵敏度高,特异性好,方便快捷的检测方法,可广泛应用于甲型肝炎病毒研究及临床检测中。而甲型肝炎病毒抗原双抗体夹心ELISA检测法,检测灵敏度适中,操作简单,更适用于甲肝疫苗生产检定。     

用生物素-亲和素ELISA法检测人胚肺二倍体细胞培养的甲型肝炎病毒抗原

利用生物素-亲和素生物放大系统的原理,建立了新的检测细胞培养的甲型肝炎病毒抗原的方法。用生物素标记的抗甲肝IgG,与免疫偶联于固相的甲肝抗原作用,然后用亲和素-生物素辣根酶复合物(ABPC)与生物素化的IgG偶合,邻苯二胺(OPD)显色。该法在检测甲肝抗原中获得满意结果,灵敏度比普通ELISA法提高约10倍,非特异性显著降低。该法可进一步发展成为一种高特异性的,灵敏的甲肝临床诊断和流行病学调查的技术。     

单克隆的制备时间大大减少

约翰·霍普金斯(John Hopkins)大学的科学家发明了一种技术,这种技术能大大减少培育产生需要的专性单克隆抗体杂交瘤的时间。诺法(Nova)药品公司(莫里斯城)得到了这项技术在全世界的专利权,并计划向单克隆抗体生产者发技术许可证,以及应用这些技术发展诺法药品公司的治疗学和诊断学。据诺法公司说,新技术(已提出申请专利权)大大增加了杂交瘤生产需要的抗体的产量,使之从通常的1～5％提高到100％,因而大大减少了分     

一种新型的抗原检测系统——免疫-PCR

一种新的抗原检测系统(技术)——免疫-PCR,最近由Takeshi Sano等发明。该系统以特定DNA分子作为标记物,利用链霉亲和素与蛋白A的交链物既能与生物素又能与抗体结合的双重特性,将抗原抗体复合物和生物素化DNA连接起来,形成特定的抗原抗体复合物-链霉亲和素蛋白A交链物-生物素化DNA结合物。     

生物素-抗生物素系统免疫酶法用于乙型肝炎“e”系统检测的研究

近年来生物素-抗生物素系统(Biotin-Avidin-System)在免疫学技术中的应用,日益为国内、外学者所重视。这一技术的使用,大大提高了方法的灵敏度,为微量抗原和抗体的检测开辟了新的途径。我们在探讨这一新的技术中,运用标记抗生物素和生物素法(LAB法),检测乙型肝炎e系统,初步获得良好的效果,现报道如下:     

用生物素标记的葡萄球菌蛋白A(SPA)检测日本脑炎抗体

<正>自从亲和素和生物素特异性相互反应由Guesdon(1979)引入ELISA以来,此方法已被广泛采用为一种有用的技术,以检测和定量免疫球蛋白或抗原。用生物素标记的抗猪免疫球蛋白(Ig)抗体,结合酶标记亲和素结合物的ELISA,也已成功用到作者     

利用微秒和微纳秒脉冲电场诱导细胞融合

[目的]以小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞作为实验材料,比较了SP2/0细胞在不同微秒(μs)脉冲和微纳秒(μs/ns)复合脉冲电融合的细胞存活率和融合率,并确定了最优的μs/ns复合脉冲电融合参数。[方法]将SP2/0细胞分别用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)进行染色,分别选取3组μs脉冲和3组μs/ns复合脉冲对染色后的SP2/0细胞进行电融合,通过荧光显微镜观察融合后细胞的存活率和融合率。[结果]对比不同μs和μs/ns复合脉冲电融合存活率和融合率结果得知,μs/ns复合脉冲比μs脉冲电融合效果更好,且电融合参数为2. 5 k V/cm、20μs、1次,10 k V/cm、200 ns、8次时存活率和融合效率相对最好,存活率和融合率分别为88. 5%±6. 2%和80. 1%±2. 6%。[结论]通过采用不同μs和μs/ns复合脉冲电融合比较了SP2/0细胞的存活率和融合效率,结果显示μs/ns复合脉冲电融合参数在2. 5 k V/cm、20μs、1次,10 k V/cm、200 ns、8次时,存活率比μs脉冲电融合提高6. 4%,融合率提高23. 3%,为利用μs/ns复合脉冲研究杂交瘤细胞电融合奠定了基础。     

PLGA人工抗原提呈细胞载体的制备

目的:目前常用的载体材料,在体内很难降解,限制了其在体内的应用,本文通过用PLGA微球制备人工抗原提呈细胞(AAPC)载体,对其功能进行验证.希望此方法能弥补传统方法的不足.方法:将软脂酸偶联到亲和素上,然后按照传统的复乳法来制备PLGA微球,并且通过使用荧光素(FITC)标记、生物素化的牛血清蛋白(BSA)对其功能进行验证.结果:通过该方法可以得到表面固定生物素的PLGA微球,并且证明软脂酸修饰并未影响到亲和素分子和生物素的结合,生物素化的BSA分子可以有效的结合到微球的表面.结论:PLGA微球表面很难引进合适的化学基团,导致其不能像聚苯乙烯微球那样通过化学反应来将亲和素分子固定在微球的表面上,通过将软脂酸偶联到亲和素分子上,可改变其表面很难引进合适的化学基团的不足,用其微球可用于制备AAPC载体.人工抗原提呈细胞是免疫学研究领域的新思路,可在基础免疫研究和临床治疗方面发挥较大的作用,但作为一门新兴技术,在制备、效果评价及应用方面需要逐渐完善和成熟,用PLGA微球为载体构建,弥补了磁珠、聚苯乙烯不能在体内降解的不足,且安全无毒,可供参考.     

空间细胞电融合关键技术的地基研究——烟草细胞的电融合

本文针对建立空间细胞电融合技术存在的三个主要问题进行了研究。结果表明,用低温(4℃)、融合介质(0.55 mol/L甘露醇)并添加0.1%纤维素酶保存原生质体,72 h内可以使约94%细胞维持无壁状态,同时并未使细胞丧失再生能力,基本满足从地面制备亲本细胞到在微重力条件下进行电融合,对亲本细胞保持无壁状态的要求。为减少剪切力环境对亲本细胞造成的损伤,一方面用超速离心方法对亲本细胞之一去液泡,另一方面用电泳代替蠕动泵混合亲本细胞。而且,由于原生质体壁生长与其膜电位之间存在负相关性,因此利用电泳方法可以有效地富集和优化亲本细胞。根据地面实验结果推测,空间有/无液泡亲本细胞电融合的较适合参数可能为:交流电场强度90V/cm,频率0.8 MHz,排列时间20 s,直流脉冲1.0—1.3 kV/cm,幅宽40μs,两次脉冲。     

酶联免疫吸附试验技术方法的进展

<正>酶联免疫吸附试验(Enzgme—Linked immunosorbentassay.ELISA)是由Engvall和Peylman)及Vanweemen和Schuttys)于1971年首先提出的一种用酶标记抗体或抗原的方法,该方法将抗原抗体的免疫反应和酶的催化作用结合起来,可敏感地检测体液中微量的抗原或抗体,用于多种疾病的诊断和血清流行病学调查,近10余年来,国内外许多学者为了进一步提高它的敏感性和特异性,在技术方     

抗生物素蛋白-生物素免疫荧光技术检测细胞培养中增殖的甲型肝炎病毒抗原

检测细胞培养增殖甲型肝炎病毒抗原(HAAg)的敏感方法主要有直接免疫荧光(DIF),间接免疫荧光(IDIF),固相放射免疫(RIA)及放射免疫斑分析(RIFA)等。本文第一次报告用抗生物素蛋白-生物素(Avidin-Biotin)放大作用提高免疫荧光技术的敏感性应用在细胞培养中检测HAAg,生物素化抗甲肝IgG与抗生物素蛋白联结的荧光素偶合检测(BA-FA)与DIF比较,BA-FA不仅可获得背景清晰的荧光。而且快速、节省特异抗体,BA-FA特异性亦好。     

生物素-亲和素系统及其应用(续二)

<正> 八、生物素衍生物 (一)生物素化大分子 用于生物素化的生物大分子物质最常见的是抗体。由于抗体分子上的氨基基团极易被活化生物素即生物素酸-N-羟基丁二酰亚胺(BNHS)所酰化,从而可使一个抗体分子接上多个抗生物素蛋白分子起反应。通常选用抗抗体(第二抗体)接上生物素,以便使用于不同的抗原-抗体反应体系。     

定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子BA-ELISA方法的建立与评价

目的:建立一种定量检测囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)方法并评价其可靠性。方法:优选设计CFTR三个表位的大肠杆菌表达抗原,免疫新西兰白兔获得CFTR多克隆抗体,用纯化后的抗体包被酶标板,并用生物素对其标记,从人精子提取CFTR作为抗原,用辣根过氧化物酶偶联的亲和素检测,优化两种抗体浓度及实验参数,建立可定量检测CFTR蛋白的双抗体夹心BA-ELISA方法;用临床精子标本评估所建立方法的重复性、特异性等。结果:CFTR包被抗体和生物素化CFTR抗体最适浓度分别为4μg/ml和10μg/ml,最佳封闭液为1%BSA-PBST,抗原与包被抗体最佳反应时间60 min,底物显色最佳时间15 min。批内、批间变异系数分别为2.16%~9.23%和2.29%~11.71%,包被的CFTR抗体与精子胞浆蛋白无交叉反应,最低检出下限为0.15 ng/ml,标准反应曲线具有良好的线性关系R2=0.962。结论:成功创建了定量检测CFTR蛋白的ELISA方法,具有特异性强、灵敏度高等特点。     

运用高效率电融合技术建立抗-hCG杂交瘤细胞株

应用本实验室研制的细胞电穿孔融合仪和平行不锈钢丝多电极小池,以及独立开发的杂交瘤细胞电融合标准程序,对绒毛膜促性腺激素(hCG)免疫的一只Balb c小鼠B淋巴细胞和NSl骨髓瘤细胞进行了电融合.实验以1/5的B细胞进行电融合,共铺96孔培养板536孔,产生317孔杂交瘤细胞克隆,检测出稳定的强阳性克隆22孔;以4/5的B细胞进行了对     

哺乳动物细胞电融合技术及其影响因素的研究进展

细胞电融合技术是指利用电脉冲促使两个或更多个不同的细胞融合在一起的过程。由于可以获得较高的融合率,而且可以在显微镜下定向诱导细胞融合和直接挑选杂种细胞,故电融合技术得到了广泛的应用。电融合技术对于哺乳动物杂种细胞的构建;哺乳动物四倍体发育的研究;以及胚胎细胞核移植都具有十分重要的意义。因此,人们对哺乳动物的电融合问题进行了大量的研究,现将这方面的研究进展做一综述。 (一)电融合技术的原理及方法 悬于平行电极之间的低电导率溶液中的细胞,在适当强度与持续时间的直流电脉冲的刺激下,其细胞膜可发生可逆电击穿,此时如两个具有膜微孔的细胞紧穿接触,可导致细胞质桥的形成,进而发生细胞融合。     

加载HCMV抗原肽的HLA-A*0201单体及其四聚体制备和鉴定

细胞毒T淋巴细胞(CTL)在控制病原体感染以及抗肿瘤过程中发挥重要作用,因而特异性CTL的检测相当重要;而过去检测CTL的方法都是间接的,最近发展起来的四聚体技术则是直接检测抗原特异性CTL的有效而特异的方法,成为目前研究T细胞免疫应答的关键技术。报道一种简化的四聚体制备程序,利用该程序成功制备加载人巨细胞病毒(HCMV)抗原肽的HLA-A2四聚体,具有特异性结合CTL活性。HLA-A*0201重链基因是通过RT-PCR方法从HLA-A2⁺供者白细胞中克隆,进而以PCR方法构建在羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*0201(A2)重链胞外区原核表达载体, A2重组蛋白在大肠杆菌中得到高表达,主要以包涵体形式存在。加载抗原肽的可溶性A2单体是A2胞外区在轻链β2微球蛋白和HLA-A2限制性HCMV pp65_495-503抗原肽(NLVPMVATV,NLV)存在时通过稀释法复性获得,以BirA对其进行生物素化,然后以阴离子交换树脂纯化,得到的纯化A2-NLV单体与Streptavidin_PE按4:08比例混合形成四聚体,结合程度在85％以上,流式细胞仪分析显示该四聚体具有与HLA-A2+供者的特异性CTL结合活性。总之,这种简化的四聚体制备程序,不仅有利于该技术的推广,为特异性T细胞免疫研究建立必要的技术平台,而且A2-NLV四聚体在临床监测CMV特异性CTL水平等方面也有应用价值。     

副流感病毒IgM抗体AlphaLISA快速检测方法建立

副流感病毒(Parainfluenza virus,PIV)是较为常见且广泛的社区性获得性抗原,其感染率仅次于呼吸道合胞病毒.由于PIV感染的临床表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别,所以早期、快速、准确诊断尤为重要.本文建立PIV IgM抗体的AlphaLISA快速检测方法,PIV特异性抗原与待测样品中PIV IgM抗体结合使供体微珠和受体微珠相互接近时,激光激发级联反应,从而产生放大的信号.通过对PIV特异性抗原生物素标记量和稀释比例的摸索,确定最佳反应体系.该方法批内和批间变异系数均小于10％,与间接免疫荧光方法比对,总符合率高于95％,且不与其他7种常见呼吸道病原体的IgM抗体发生交叉反应.AlphaLISA方法操作简便,整个反应过程只需要25 min,可快速检测PIV的IgM抗体,为早期确诊PIV感染提供有效办法.     

结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的:建立2种结核分枝杆菌(Mtb)抗体的双抗原夹心ELISA检测方法,并初步评价其在Mtb血清学临床辅助诊断中的应用价值。方法:采用Mtb融合抗原38k D+ESAT6+CFP10作为包被抗原,分别以辣根过氧化物酶(HRP)和生物素(Bio)标记的38k D+ESAT6+CFP10作为标记抗原,建立2种Mtb双抗原夹心ELISA法,即HRP-ELISA法和Bio-ELISA法;采用所建立的2种方法对结核患者和健康对照血清进行检测。结果:经过一系列的反应条件优化,确定HRP-ELISA法和Bio-ELISA法的最佳抗原包被浓度分别为2、0.25μg/m L,最适加样量均为100μL血清原液,最佳标记抗原稀释率分别为1∶500、1∶2000,检测的灵敏度分别为43.66%、52.11%,特异性均为100%。结论:建立了2种Mtb双抗原夹心ELISA法,它们均适用于Mtb血清学的临床辅助诊断。     

蚕豆叶肉原生质体电融合的研究

本文研究了蚕豆叶肉原生质体经透明质酸酶、核糖核酸酶、神经氨酸酶、碱性磷酸酶、胰蛋白酶、脂肪酶六种水解酶和SDS、Triton X-100、CTMAB三种表面活性剂以及秋水仙素、细胞松驰素B处理后的电融合过程。结果表明:胰蛋白酶处理后的原生质体融合率明显下降;碱性磷酸酶、脂肪酶以及核糖核酸酶、透明质酸酶、神经氨酸酶处理的原生质体电融合率均有不同程度的上升。Triton X-100和CTMAB促进原生质体的电融合,但较高浓度(0.01%)的SDS起抑制作用。秋水仙素和细胞松驰素B处理的原生质体其电融合率有较大幅度的增高。