用毛细管电泳法进行C端酰胺化结构分析和酰胺化酶活？…

利用酰胺化基团与羧基在一定的缓冲液中表现出不同的电性和疏水性,建立了以毛细管电泳为基础的多钛Ｃ端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定的新方法。     

肽的α-酰胺化研究进展

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶PAM催化完成.PAM是一个双功能酶,含有两个催化结构域：PHM和PAL,顺序催化酰胺化两步反应.PAM的ｍRNA和蛋白质具有多样性.作为活性肽生物合成途径中的限速酶,PAM的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节.     

肽的α—酰胺化研究进展

α－酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶ＰＡＭ催化完成。ＰＡＭ是一个以功能酶,含有两个催化结构域：ＰＨＭ和ＰＡＬ,顺序催化酰胺化两步反应,ＰＡＭ的ｍＲＮＡ和蛋白南具有多样性,作为活性肽生物合成途径中的限速酶,ＰＡＭ的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节。     

基因工程表达产物的体外酰胺化加工

以Ｃ端为甘氨酸的修饰型人降钙素（ｍｈＣＴ－Ｇｌｙ）的融合蛋白为底物和利用重组酰胺化酶,研究建立基因工程表达产物的体外酰胺化加工系统。首先,人工合成ｍｈＣＴ－Ｇｌｙ基因,并构建其融合表达质粒ｐＧＥＸＣＴ,在大肠杆菌中获得了高效表达并通过新和层析分离纯化获得谷胱甘太Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合蛋白（ＧＳＴ－ｍｈＣＴ－Ｇｌｙ）。同时,从稳定表达在鼠酰胺化酶的ＣＨＯ细胞株中制备了重组酶腕化酶。然后,利用此重组     

多肽酰胺化酶的结构与功能

C端酰胺化是许多神经内分泌多肽重要的翻译后加工过程,是在酰胺化酶的催化下分两步进行的,PHM和PAL分别催化这两步反应.PHM由两个结构相似的结构域组成,每个结构域均为九链β折叠组成的三明治样结构,分别由三个His或两个His和一个Met螯合一个Cu组成活性中心.在一个反应周期中,两个Cu分别独立地与抗坏血酸和分子氧发生单电子传递的氧化还原反应,最后完成多肽底物的α-碳的羟化反应.     

大鼠α-酰胺化酶(α-AE)在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,C末端α酰胺基团的存在对于许多生物活性肽的生物活性极为重要。本研究通过PCR扩增获得了编码大鼠α-酰胺化酶的基因,以pET-30a为载体,重组质粒pET-A转化至 E.coli BL21成功表达了α-酰胺化酶。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化重组蛋白。该蛋白具有催化三肽底物((Dns-Tyr-Val-Gly)成为酰胺化二肽 (Dns-Tyr-Val-NH2)的酶活性,这表明重组蛋白是α-酰胺化酶,有可能用于生物活性肽的酰胺化研究。     

多肽分子中C-末端酰胺化氨基酸残基的鉴定

本文报道了一种新的鉴定多肽分子C-末端酰胺化氨基酸残基的方法,17种酰胺化氨基酸的DABTC衍生物标准品在高效液相色谱上得到充分分离与鉴定,采用上述方法对多肽激素TRH、LHRH、SP及PLG中的C-末端酰胺化氨基酸残基的鉴定同样得到满意结果。     

C-末端酰胺化酶的研究进展

Ｃ－末端酰胺化酶的研究进展王翔林（沈阳药学院沈阳１１００１５）Ｃ－末端酰胺化酶（Ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌα－ＡｍｉｄａｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ,ｃ－ＡＥ）,又称甘氨肽酰化单氧酶（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅα－Ａｍｉｄａｔｉｎｇｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ,ＰＡＭ,ＥＣ１．１４．１７．１３）是动物体内普遍存在的一种酶。     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活性表达及在体外酰胺化修饰中的应用

将大鼠脑cDNA库来源的PAM基因片段,经克隆重组,构建成真核表达质粒pSV—PAM,并转染CH0细胞,获得在cHO中稳定表达活性型口α-酰胺化酶的细胞株DGAE。表达产物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明,以α—N—acetyl－Tyr-Val-Gly为底物,该酶催化反应的Km为12．Sμmol／L,V_max为180μmol／mg／h,而且催化反应中表现有最适铜离子浓度和pH值范围。表达的双功能酶可直接用于合成的多肽和基因工程表达产物的酰胺化加工修饰。     

牛胰岛素的酰胺化反应及其六酰胺产物的分离及鉴定

牛胰岛素用1％三氟化硼甲醇溶液反应后所得六甲酯与饱和氨甲醇溶液反应,在室温下约经144小时可完全酰胺化。反应过程用红外光谱及酰胺含量分析测定。所得酰胺化粗产品经Sephadex G-75凝胶层析可以将胰岛素六酰胺化合物从其聚合物中分离提纯。由红外光谱、紫外光谱及圆二色散光谱测定表明:牛胰岛素的六酰胺化合物的构象与胰岛素有很大不同,其生物活性也丧失殆尽。     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活怀表达及在体外酰胺化？…

将大鼠脑ＣＤＮＡ库来源的ＰＡＭ基因片段,经克隆重组,成真核表达质粒ＰＳＶ－ＰＡＭ〈并转染ＣＨＯ细胞,获得在ＣＨＯ中稳定表达活性型α－酰胺化酶的细胞株ＤＧＡＥ。 物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明。以α－Ｎ＿ａｃｅｔｙｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ为底物,该酶催化反应的Ｋｍ为１２．５μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１８０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ,而且催化反应中表现中有最适铜离子浓度     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

酰胺化酶基因导入非内分泌细胞并表达

群马大学内分泌研究所教授竹内利行等使用非内分泌细胞合成了肽激素活性分子,这一结果在4月京都日本医学会总会上发表.在载体上搭载降钙素(CT)基因和酰胺化酶基因,导入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),产生酰胺化的活性型CT. 内分泌细胞首先作为生物合成前体肽激素,使经处理和酰胺化形成的活性型积集在分泌颗粒上,经外界刺激被释放.在淋巴系细胞和上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮系细胞等易培养的非分泌系细胞直接表达活性肽,并大量生产有很多优点.竹内等打算开发用皮肤细胞代替人工胰脏等.     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫     

大鼠α-酰胺酶在变铅青链霉菌中的克隆及表达研究

α－酰胺酶（α－ａｍｉｄａｓｅ,α－ＡＥ）催化神经和内分泌系统中活性多肽的Ｃ－端酰胺化,多多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增获得编码α－酰胺酶的ｃＤＮＡ,并进行了克隆和测序。为了使α－酰胺酶能在链霉菌中分泌表达,将其ｃＤＮＡ与链霉菌酷氮酶酶（ｍｅｌＣ１）信号的编码序列融合得到融合ｍｅｌ／ＡＥ,将ｍｅｌ／ＡＥ插入链霉菌质粒ｐＩＪ６８０,获得重组质粒ｐＩＪ     

壳聚糖接枝改性PET 人工韧带的表面结构与特性研究

目的:于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带材料表面接枝壳聚糖长链分子,对改性PET人工韧带的表面结构与特性进行分析,以期为较好生物相容性的PET人工韧带材料的设计和研发奠定一定的理论基础和技术支持。方法:首先采用化学接枝法在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)织物表面接枝丙烯酸(PET-AAc),再与壳聚糖分子发生酰胺化反应实现PET表面的壳聚糖接枝(PET-CHI)。借助接触角、x射线光电子能谱(XPS)、傅立叶红外光谱(FTIR)、热失重(TG)和扫描电镜(SEM)等对PET改性效果进行分析表征。结果:壳聚糖长链分子成功接枝到PET表面,壳聚糖在PET表面的接枝厚度为2.25μm,接枝量为9.66 wt%。结论:接枝改性后PET表面亲水性有较大提高,浸润性得到改善。     

酶的酰胺化作用一步法

<正> 美国 Unigene 实验室发现一种酶,这种酶能够迅速有效地使肽的羧基终端酰胺化。细菌和酵母不能使蛋白质酰胺化,但许多重要的人类蛋白,包括降血钙素、生长激素释放因子、促皮质素释放因子、胰酶分泌素和其它神经肽和胃肽。(可以通过 rDNA 来制造),需要酰