嗜水气单胞菌毒力基因的研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),为人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中,是多种水产动物的主要致病菌。国内外学者对其进行了许多研究,现普遍认为嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒素密切相关。随着分子生物技术的发展,已有许多学者从分子水平上对嗜水气单胞菌进行了研究,为阐明嗜水气单胞菌的致病机理提供了一些理论依据,并建立起针对几种主要毒力因子的检测手段。本文将嗜水气单胞菌目前的研究策略、部分主要毒力因子及其检测手段作一综述,以期为嗜水气单胞菌致病机理的研究及嗜水气单胞菌病的防治提供参考和借鉴。       

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B, gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10³ cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。     

嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性。基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要。目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少。[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因和16S rRNA基因特异性片段(5个基因片段)的多重PCR快速检测方法。[方法]采用选择性RS (Rimler-Shotts)培养基对样品中嗜水气单胞菌有效富集分离和辨认,建立并优化嗜水气单胞菌16S rRNA、ast、alt、aerA、act这5个基因的多重PCR方法,比较菌落PCR中DNA模板不同提取方法对多重PCR扩增结果的影响,并检测该方法对维氏气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌的特异性。[结果]通过对RS培养基上单菌落的16S rRNA基因鉴定,初步判定嗜水气单胞菌和其他可培养菌的菌落形态,对其富集程度进行可视化辨别。多重PCR反应体系优化结果显示,引物浓度最优配比为16S rRNA:ast:alt:aerA:act=1:2:2:3:4。菌落PCR结果显示,...     

嗜水气单胞菌感染现状及耐药分析

目的调查湖州市中心医院嗜水气单胞菌感染现状和耐药情况。方法采用常规方法分离,用VITEK-32全自动微生物分析仪进行菌种鉴定为嗜水气单胞菌或豚鼠气单胞菌,依据葡萄糖产气反应鉴定为嗜水气单胞菌。并根据配套药敏卡进行药敏试验。结果共分离到34株嗜水气单胞菌,主要来自痰液、胆汁、腹腔引流液或腹水。嗜水气单胞菌对哌拉西林、替卡西林、阿莫西彬克拉维酸、妥布霉素、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、复方新诺明耐药率为52．9％～73．5％。结论目前嗜水气单胞菌也呈现多重耐药现象,临床上应予以重视。     

一种精子表面GPI锚定蛋白初步鉴定方法的建立

精子表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白(GPI-Aps)在精子不同阶段都发挥着关键作用.本研究介绍了嗜水气单胞菌毒素（aerolysin）作为生物探针来鉴定精子表面的GPI锚定蛋白.实验依次进行了嗜水气单胞菌培养、毒素提取纯化、多克隆抗体制备以及三明治蛋白印迹验证实验.凝胶蛋白分离实验显示,硫酸铵沉淀加Sephadex G-100层析柱纯化得到了分子质量为45 kD高纯度细菌毒素|蛋白印迹实验验证了制备的多克隆抗体的特异性|三明治蛋白印迹结果显示,嗜水气单胞菌毒素能识别出12条精子脂筏提取蛋白条带,其分子质量主要分布在15~130 kD之间|Alex488标记的免疫荧光实验显示,嗜水气单胞菌毒素识别的GPI锚定蛋白主要分布在精子头部和尾部.研究结果提示,嗜水气单胞菌毒素能够有效地识别精子表面的GPI锚定蛋白.     

翘嘴鳜病原嗜水气单胞菌分子特征及LAMP检测方法的建立

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌, 为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术, 实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究, 同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aerA为分子靶标设计引物, 利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果表明, 本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6×106 CFU/mL, 携带aerA等14种毒力基因, 此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测。以气溶素基因aerA设计引物进行的环介导恒温扩增, 结果显示可扩增出阶梯状条带, 加入SYBR Green I染色后呈现绿色的阳性反应, 而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色, 表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性; 灵敏度检测的最低检测限为4.6×101 CFU/mL; 10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液, 提取DNA后进行LAMP方法检测, 结果均可获得阳性扩增结果, 而对照未染菌组呈阴性, 表明该方法具有较好的应用性, 可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。     

和厚朴酚对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为了研究不同浓度和厚朴酚对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)致病力的影响, 筛选抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物, 通过溶血试验、免疫印记试验、荧光定量PCR试验和动物试验进行了研究。结果发现, 和厚朴酚能在亚抑菌浓度下降低嗜水气单胞菌培养物上清中的溶血活性; 蛋白免疫印迹试验发现和厚朴酚能降低嗜水气单胞菌气溶素的分泌; 荧光定量PCR试验进一步表明和厚朴酚与嗜水气单胞菌共培养后降低了气溶素编码基因aerA的转录而降低气溶素的分泌。此外, 通过动物试验发现和厚朴酚治疗能显著提高斑点叉尾鮰( Ictalurus punctatus )嗜水气单胞菌感染模型的存活率。以上研究表明, 和厚朴酚能通过降低气溶素编码基因aerA的转录而降低嗜水气单胞菌的致病力, 和厚朴酚是一种潜在的新型抗嗜水气单胞菌感染的先导化合物。     

CP7抗菌蛋白对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理

[目的]研究多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)对嗜水气单胞菌的抑杀作用机理,为防治嗜水气单胞菌引起的鱼病提供新的潜在天然药物.[方法]采用抑菌试验、钼锑抗比色法和紫外光谱法研究其对嗜水气单胞菌S12菌株生长、磷泄漏和生物大分子的影响,并利用扫描电镜和透射电镜观察了嗜水气单胞菌细胞结构遭受的破坏作用.[结果]CP7ACP对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径约8.1 mm,最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)分别为原液浓度的1/8和1/4;嗜水气单胞菌受CP7ACP处理后,电镜观察发现其细胞壁、细胞膜、细胞器以及菌体均受到不同程度的破坏,胞内的生物大分子和磷泄漏明显,基因组DNA发生增色效应.[结论]CP7ACP抑制嗜水气单胞菌生长,可用于防治嗜水气单胞菌引起的鱼病.     

一种检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法

建立一种快速诊断致病性嗜水气单胞菌的PCR法。根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及丝氨酸蛋白酶基因设计4对引物,经PCR反应条件优化后进行检测。结果表明,仅嗜水气单胞菌呈阳性,其检测敏感性高,可检测100 fg的DNA模板。20株大鲵源嗜水气单胞菌经四重PCR法检测时,有18株呈阳性。其中,毒力基因种类较多的阳性菌株经人工感染试验和胞外产物活性检测时显示出较高的致病性。利用该PCR法进行的其他检测中,还发现33份人工感染样本全部呈阳性,34份疑似样本有21份呈阳性,说明四重PCR法可应用于临床检测。本研究建立的四重PCR法具有高度敏感性和特异性,可用于嗜水气单胞菌快速诊断。     

致病性嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性鉴定

嗜水气单胞菌是一种人-兽-鱼共患的条件致病菌,本研究旨在利用单克隆抗体技术,制备抗致病性嗜水气单胞菌抗体。以嗜水气单胞菌CCTCC M2014157野生型菌株免疫BALB/c小鼠,利用间接酶联免疫吸附测定技术筛选,获得能够稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。制备的腹水依次采用饱和硫酸铵沉淀和Protein-G柱亲和层析纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗体纯度。制备的腹水抗体效价达16 000,纯化后(4 mg/mL)效价达8 000,亚型鉴定为IgG2a。特异性分析显示,纯化后抗体能与嗜水气单胞菌结合,与11株常见的致病菌均无交叉反应。本研究为快速检测致病性嗜水气单胞菌提供参考。     

黄芩苷对嗜水气单胞菌生物膜形成的影响及体内外的抑菌作用

[目的] 探讨中药单体黄芩苷对嗜水气单胞菌在体内外生长及生物膜形成的影响。[方法] 体外实验中,利用牛津杯法检测抑菌圈直径,结晶紫法检测生物膜的形成,通过泳动实验检测黄芩苷对嗜水气单胞菌运动性的影响,紫外吸收法检测细胞膜完整性,用透射电镜技术观察黄芩苷对细菌形态的影响。体内实验利用草鱼为对象检测黄芩苷对嗜水气单胞菌增殖的影响。[结果] 黄芩苷在体外对嗜水气单胞菌有明显的抑菌效果,通过对生物膜的研究发现黄芩苷对生物膜形成具有抑制作用,并同时抑制其运动性。同时黄芩苷可以破坏细胞结构,并增加了细胞膜通透性。体内实验结果显示黄芩苷对嗜水气单胞菌具有清除作用,且具有一定的浓度依赖性。[结论] 黄芩苷在体内外均具有抑制嗜水气单胞菌增殖的作用,有望在水产养殖病害防治工作中得到应用。     

西伯利亚鲟源嗜水气单胞菌致病菌的分离及其全菌苗的免疫效果

从患细菌性败血症的西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的体内分离到一株致病菌株X1,其对西伯利亚鲟的半数致死浓度(LC50)为5.62×105 cfu/ml,具有较强毒力;经ATB细菌鉴定仪生理生化鉴定和16SrDNA序列分析,菌株X1为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);其系统发育分析表明,菌株X1与嗜水气单胞菌ATCC35654(登录号:X74676.1)的亲缘关系最近,其同源性为99%.用0.30%福尔马林灭活,将菌株X1制成灭活全菌苗,对西伯利亚鲟进行注射免疫.研究结果表明,嗜水气单胞菌X1全菌苗能够明显提高西伯利亚鲟的血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,有利于进一步增强西伯利亚鲟血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶含量.此外,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染也具有较好的免疫保护作用,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为50%,而且在嗜水气单胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐剂,嗜水气单胞菌X1全菌苗对西伯利亚鲟抗嗜水气单胞菌X1人工感染的免疫保护作用更好,其对西伯利亚鲟的免疫保护率为70%.因此,将嗜水气单胞菌X1全菌苗用于西伯利亚鲟细菌性败血症的防治具有广阔的发展前景.     

嗜水气单胞菌致病性研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)是我国养殖鱼类的重要病原,对其侵袭机制和毒力因子的研究有重要的意义。本文对嗜水气单胞菌的生物学特性、致病机制、毒力因子及其防治措施进行了综述。     

嗜水气单胞菌耐四环素的蛋白质组学初步研究

采用四环素次抑菌浓度对嗜水气单胞菌进行选择,筛选得到耐四环素的嗜水气单胞菌菌株,其MIC（最低抑菌浓度）为出发菌株的8倍。通过比较对照菌与耐药菌总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个差异显著的蛋白点。对这3个差异蛋白质进行肽质量指纹及其生物信息分析,分别鉴定为核糖体小亚基蛋白、药物排出系统蛋白和乙酸乙酰辅酶A转移酶亚基。文中对嗜水气单胞菌耐四环素的机理进行了初步探讨。     

几种中药单体和抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性研究

考察没食子酸等6种中药单体和诺氟沙星等3种抗生素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的体外抑菌活性及其联合抑菌作用。通过琼脂扩散法测定受试物的抑菌作用,用微量二倍稀释法测定受试物最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,用棋盘法考察受试物的联合抑菌作用。6种中药单体中没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌抑制作用较强,抑菌圈均达到20 mm以上,没食子酸对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌的MIC和MBC均为250 g/mL;槲皮素对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为500 g/mL,对温和气单胞菌的MIC和MBC分别为250和500 g/mL;而大黄素甲醚等4种中药单体无明显的抑菌作用。嗜水气单胞菌及温和气单胞菌对诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考等抗生素均极敏感。在联合药敏试验中,没食子酸与恩诺沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对嗜水气单胞菌具有相加抑菌作用;没食子酸与恩诺沙星联合用药对温和气单胞菌具有协同抑菌作用,没食子酸与诺氟沙星或氟苯尼考、槲皮素与氟苯尼考联合用药对温和气单胞菌具有相加抑菌作用。没食子酸和槲皮素对嗜水气单胞菌及温和气单胞菌具有显著的抑制作用,二者与恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考等抗生素联合应用具有相加或协同作用,有助于降低抗生素的用量及残留。       

三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌

[目的]建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的PCR.方法.[方法]根据嗜水气单胞菌的16S rRNA、气溶素基因(aer)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的保守序列设计了3对引物,然后进行了PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的检测并与普通的细菌分离鉴定进行了临床样本和人工攻毒样本检出率的比较.[结果]该方法特异性好,只对致病性嗜水气单胞菌呈阳性扩增;敏感性高,最低可检测100fg的细菌DNA模版.对临床疑似黄鳝(Monopterus albus)样本的检出率为81.8%,高于细菌分离的40.9%;对人工攻毒鲫鱼(Carassius auratus)样本的检出率为87.5%,高于细菌分离的67.5%.[结论]本方法的成功建立,实现在同一反应管中同时对16SrRNA、aer和ahp的检测,避免了只针对aer或ahp单个毒力基因的PCR检测方法可能存在的漏检和误检,为致病性嗜水气单胞菌的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的检测方法.     

细菌酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究

本文应用纸片法筛选出5种动物病原菌的醋酶同工酶阳性株,并对3种强阳性株应用PAGE进行酶谱测定。同时对这些细菌酯酶同工酶样品的提取及测定条件进行了摸索。结果表明：不同细菌酯酶同工酶酶谱存在着显著差异。这为某些细菌种鉴定提供一种方法。     

嗜水气单胞菌外膜囊泡组分及功能分析

嗜水气单胞菌是一种鱼类常见的致病菌,且每年养殖业因感染该菌所造成的损失不也计其数。据研究表明,细菌的外膜囊泡具有免疫保护功能,然而目前对嗜水气单胞菌OMVs组分及其功能的研究还鲜有报道。故本研究首次分离纯化得到嗜水气单胞菌分泌的OMVs,然后利用其免疫小鼠的血清进行抑菌实验,结果表明抗OMVs血清具有良好的抑菌效果。为了进一步了解嗜水气单胞菌的OMVs蛋白的特性,本研究通过利用蛋白质组学技术对其蛋白组分进行分析。经结果分析共鉴定到191个蛋白,包括外膜蛋白、脂蛋白、胞浆蛋白等;并涉及细菌氧化还原作用、跨膜转运与生物学合成等多种重要的生物学功能和过程。此外,还有一些如外膜蛋白Omp A等的毒力因子蛋白的发现,都为日后蛋白相关疫苗的研制提供了候选储备。通过本研究,我们更全面地了解嗜水气单胞菌外膜囊泡的生物学功能,不仅有助于筛选具有重要免疫保护性的蛋白,也为研制嗜水气单胞菌的相关疫苗奠定了研究基础。     

山姜素对鱼源耐药性嗜水气单胞菌体外抗菌作用的研究

旨为探究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的体外抑菌效果及其作用机制。通过测定山姜素对嗜水气单胞菌生长、细菌形态、电导率、乳酸脱氢酶(LDH)、蛋白质代谢和DNA的影响,研究山姜素对耐药性嗜水气单胞菌的抑菌机制。山姜素对5株鱼源耐药性嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为128-256μg/mL和512-1024μg/mL。与对照组相比,2MIC山姜素作用于嗜水气单胞菌CW株8 h、16 h后,菌体皱缩,细胞壁和细胞膜破损,细胞质丢失,内部空化;作用2 h后,菌悬液电导率、乳酸脱氢酶含量、DNA外渗量分别增长了3.97%、26.09%和10.50μg/mL;作用2、4和8 h后,菌悬液核酸荧光强度和密度呈现随时间降低的趋势。山姜素对嗜水气单胞菌的体外抑菌机制为损伤菌体的细胞壁、增加细胞膜的通透性来抑制其生长繁殖。     

水产品中嗜水气单胞菌耐药性研究进展

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila具有广泛的致病性,是水生动物最常见的致病菌之一。由于抗生素不合理使用、质粒以及耐药基因的水平转移等因素,来自零售市场、超市和餐厅的即食海鲜产品中,均可分离出大量的嗜水气单胞菌耐药菌株及其耐药基因。因此,探明关键控制点、寻求有效缓解抗生素耐药性的防控策略至关重要。文中介绍了我国嗜水气单胞菌的耐药现状,嗜水气单胞菌的主要侵染及耐药机制,以及目前削减和防控耐药性的主要手段和策略,并对水产品耐药性研究方向和重点作出展望。