嗜水气单胞菌菌落多重PCR方法的建立及应用

[背景]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对水产动物、畜禽和人类均有致病性。基因表达的溶血素、气溶素和肠毒素是重要毒力因子,在致病性嗜水气单胞菌早期检测及防治中尤为重要。目前采用菌落直接提取DNA用于多重PCR研究的相关报道较少。[目的]基于菌落PCR方法建立针对嗜水气单胞菌溶血性基因、肠毒素基因和16S rRNA基因特异性片段(5个基因片段)的多重PCR快速检测方法。[方法]采用选择性RS (Rimler-Shotts)培养基对样品中嗜水气单胞菌有效富集分离和辨认,建立并优化嗜水气单胞菌16S rRNA、ast、alt、aerA、act这5个基因的多重PCR方法,比较菌落PCR中DNA模板不同提取方法对多重PCR扩增结果的影响,并检测该方法对维氏气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌的特异性。[结果]通过对RS培养基上单菌落的16S rRNA基因鉴定,初步判定嗜水气单胞菌和其他可培养菌的菌落形态,对其富集程度进行可视化辨别。多重PCR反应体系优化结果显示,引物浓度最优配比为16S rRNA:ast:alt:aerA:act=1:2:2:3:4。菌落PCR结果显示,...     

采收期对青皮核桃果实生理特性与耐贮性的影响

以‘中林5号’(早熟)、‘辽宁4号’(中熟)、‘西扶1号’(中晚熟)青皮核桃果实为试材,于8月上、中、下旬3个采收期采果,在0~1℃冷藏过程中测定贮期生理指标和保鲜效应。结果显示:(1)各采收期和各品种果实呼吸强度(RI)均呈双峰型变化;8月中旬采收的果实呼吸峰出现较早,其纤维素酶(Cx)活性较另2个采收期多1个高峰;多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性增强最早,其贮后核仁酸价上升幅度最大,果实腐烂最快。(2)8月下旬同期采收的3个品种果实的贮期各生理指标变化趋于一致;贮藏54d时,果实腐烂率依次为‘辽宁4号’>‘中林5号’>‘西扶1号’。(3)‘辽宁4号’核仁可溶性蛋白质含量越高,贮后下降率最大。研究表明,青皮核桃果实采后生理代谢活性与耐贮性主要与采收时期有关,受品种影响较小,且8月中旬采收的果实采后生理代谢旺盛,耐贮藏性均最差;‘辽宁4号’果实在各采收期的耐贮性均小于其他品种果实。     

猪链球菌2型强毒株sly基因敲除株构建及生物学特征分析北大核心

[目的]构建猪链球菌2型05ZYH33溶血素sly基因敲除突变株,比较突变株与野生株生物学特征。[方法]分别克隆sly上游序列L、下游序列R和壮观霉素抗性基因spcr,构建基因敲除质粒p UC18-LSR,并电转化入05ZYH33感受态细菌。用多重PCR、RT-PCR及Southern杂交对sly基因敲除突变株进行鉴定。比较突变株与野生株的生长速率和溶血现象。[结果]多重PCR和RT-PCR分别显示,野生株DNA和c DNA都能扩增出579 bp的sly内部片段,而突变株DNA和c DNA都未能扩增出此片段。Southern杂交显示,突变株中未见sly探针杂交条带。突变株生长速率较野毒株迟缓,溶血能力减弱,但依然存在。[结论]建立了高效稳定的电转化方法,成功构建出溶血能力减弱的双交换同源重组sly基因敲除突变株。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,并与相关家族蛋白进行同源性比较,设计合成引物,PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因(enolase,eno),将其克隆入pMD-18T载体中,进一步亚克隆入表达载体pET32a.将重组表达质粒pET32a::eno转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带.通过His-Tag亲和层析纯化,获得融合蛋白His-ENO.Western-blot表明该表达产物具有免疫原性.基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S.suis 2 05ZYH33细菌的表面.这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用.     

喜马拉雅中段繁殖鸟类种域格局及 Rapoport法则检验 ——基于3 600 m海拔梯度范围的数据

物种种域的分布规律是生物地理学与生物多样性研究的热点问题。Rapoport法则认为,物种分布范围随海拔上升而增大,但其适用性一直存在较大争议。喜马拉雅山脉是全球生物多样性热点地区之一,拥有全球最广的海拔落差以及完整的垂直气候和植被带,是验证Rapoport法则的理想场所。为探讨中喜马拉雅山脉吉隆沟3 600 m海拔梯度范围内繁殖鸟类种域分布是否符合Rapoport法则,于2012和2013年的雨季,利用样线法对中喜马拉雅吉隆沟地区的繁殖鸟类进行了4次调查。在海拔1800～5 400m的调查区域内,每300m海拔梯度布设调查样线3条,共计36条样线。调查共记录到繁殖鸟类169种,种域范围低频方向呈明显偏右分布。平均种域为(1 642.29±544.63)m,中值为728.5 m。其中,种域最大为3 300 m。分别使用Stevens方法、中点法、逐种法、Pagel法和四分法对调查数据进行处理,采用线性回归方程验证其是否符合Rapoport法则。结果表明,Rapoport法则的有效性与验证方法有关,Stevens方法、中点法、逐种法均不支持Rapoport法则,而Pagel法和四分法支持Rapoport法则。综合表明,吉隆沟繁殖鸟类种域海拔格局对Rapoport法则的支持较弱,说明Rapoport法则在该区域适用性较差。     

鳜源致病性舒伯特气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

【背景】舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)广泛分布于淡、海水水体和底泥中,致病株已在我国养殖鳢科鱼类中流行,也感染其他经济鱼类,导致暴发性死亡。【目的】对病鳜(Siniperca chuatsi)的病原进行鉴定,确定分离菌的致病性及药物敏感性,为该病临床治疗提供参考。【方法】采集病鳜脾肾组织进行PCR或RT-PCR扩增其常见病毒,采集病鳜肝脏和腹水分离培养细菌,PCR扩增代表菌株的gyrB、16S rRNA和毒力基因,鉴定其生理生化特征,并进行药物敏感性试验和人工感染试验。【结果】病鳜的传染性脾肾坏死病毒、鳜蛙病毒、鳜弹状病毒检测结果为阴性,肝脏和腹水均存在大量细菌;代表菌株Gui210820被鉴定为舒伯特气单胞菌,携带溶血素、气溶素、弹性蛋白酶和磷脂酶毒力基因,腹腔注射感染鳜的半数致死浓度(LD50)为3.16×105 CFU/mL;菌株Gui210820对四环素、卡那霉素、复方新诺明等6种抗菌药物耐药,对强力霉素中介,对恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考等11种抗菌药物敏感。【结论】本试验从病鳜组织分离到致病性舒伯特气单胞菌,水产准许用药物恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考...     

喜马拉雅山东段鸟类多度-垂直分布幅关系:特有种与非特有种的对比

物种多度与分布幅之间的正相关被认为是一种普遍的规律。但近年在热带山地和岛屿的研究发现多度-分布幅关系会出现不相关或负相关的现象;该现象可能是由于当地多度高且分布幅小的特有种比例较高所导致。在喜马拉雅山东段的勒布沟沿海拔2350—4950 m开展研究：1)记录了当地鸟类多度垂直分布格局;2)验证了该区繁殖鸟总体多度-垂直分布幅关系,并对比了特有种和非特有种分组子集多度-垂直分布幅关系、平均多度和垂直分布中心的差异。研究发现勒布沟鸟类多度垂直分布格局为驼峰格局。该区繁殖鸟类与非特有种的多度-垂直分布幅关系均为正相关,但特有种的多度-垂直分布幅关系为不相关。特有种的多度及海拔分布中心位置均高于非特有种。结果表明区域的鸟类特有性对多度-垂直分布幅关系存在着重要的影响;地理隔离导致的区域物种组成差异,是造成多度-分布幅关系模式变化的重要原因之一。     

猪链球菌2型的表面蛋白烯醇化酶在细菌黏附和引发免疫下调中的作用

利用克隆表达获得了具有酶活性的猪链球菌2型(S.suis2)05ZYH33重组烯醇化酶(Enolase)蛋白。流式细胞术FCM的细胞定位发现Enolase可部分存在于S.suis205ZYH33细菌的表面。进而利用Hep2细胞探讨猪链球菌表面Enolase参与细菌对宿主细胞的黏附作用。免疫空斑试验的结果提示,Enolase可能作为一个免疫下调蛋白对于引发猪链球菌相关疾病发挥着重要的作用。     

猪链球菌2型烯醇化酶的分子克隆与免疫学特性

对新近测定的猪链球菌2型(S. suis 2) 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析, 并与相关家族蛋白进行同源性比较, 设计合成引物, PCR法扩增出约1.3 kb的烯醇化酶编码基因 (enolase, eno), 将其克隆入pMD-18T载体中, 进一步亚克隆入表达载体pET32a。将重组表达质粒pET32a::eno转化E. coli BL21 (DE3), 经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE初步检测到分子量约为75kD的蛋白带。通过His-Tag亲和层析纯化, 获得融合蛋白His-ENO。Western-blot表明该表达产物具有免疫原性。基于ELISA进行的细胞定位实验证实了Enolase可以部分存在S. suis 2 05ZYH33细菌的表面。这提示了Enolase作为一种新发现的抗原对于引发猪链球菌相关疾病可能发挥着重要的作用。